SATB1在直肠癌新辅助放疗中的作用

孟文建 王自强 于永扬 孙晓峰 周总光

大肠癌（colorectal cancer，CRC）包括结肠癌和直肠癌，是威胁人类健康的常见肿瘤之一。在中国，约70%～75%的直肠癌为中低位直肠癌，手术是主要的治疗手段。然而，即使有了全直肠系膜切除（total mesorectal excision，TME）的手术方式，但仍30%的局部进展期直肠癌患者可能环周切缘阳性，从而导致肿瘤复发［1］。术前新辅助放疗也已成为进展期中低位直肠癌治疗的标准方案，但术前放疗面临的最大的挑战是直肠肿瘤对放疗的敏感性存在较大的差异。因此，深入了解肿瘤放射敏感性的机制，有助于寻找预测放疗敏感性的分子标记，从而实现对患者的个性化筛选。SATB1作为染色质高级结构形成的基础，被称为“基因组组织者”，它能调控超过10%的基因，这些基因的功能复杂多样，从而表明SATB1基因的功能多样性［2］。近年来，SATB1在肿瘤中的重要作用备受关注，众多研究证实SATB1与喉癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展和（或）转移有关［3-7］。我们前期的研究结果［8］首次证实SATB1表达与直肠癌的进展有关。除了在肿瘤中的重要作用外，SATB1在治疗方面的价值，特别是对放化疗的反应性，日益受到人们的关注。本研究通过分析SATB1表达与预后及放疗相关因子的关系，探讨SATB1在直肠癌新辅助放疗中的作用。

资料与方法

一、一般资料

本研究选取142例参与瑞典术前放疗研究（Stockholm Trial I）的直肠癌患者作为研究对象，其中68例接受术前短程放疗（5 Gy/次，共25 Gy）（RT组），74例未接受术前放疗（non-RT组），包括直肠癌组织（n=142）和相应的正常黏膜组织（n=107）、术前活检癌组织（n=84）以及转移淋巴结（n=43）。所有患者无局部手术或化疗病史，且术前经影像学检查排除远处转移。其中男性80例，女性62例。年龄37～75（中位年龄57岁）。放疗结束1周后手术，患者新辅助放疗前活检及术后切除肿瘤组织、正常组织以及转移淋巴结标本均经病理学检测确诊。两组患者的基线特征无统计学差异（P＞0.05，表1）。中位随访期为75个月（0～193个月）。本研究得到了瑞典和四川大学伦理审查委员会的批准。

表1 患者及肿瘤的临床病理特征

二、免疫组织化学染色

收集的直肠癌组织和相应的正常黏膜组织、术前活检癌组织以及转移淋巴结组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，使用手动点样仪（英国Beecher公司）构建组织芯片。从每个切片中选取3个形态学上有代表性的区域，并从中取3条柱形中心组织（直径0.6 mm）包埋进蜡块中，使用显微薄片切片机5 um厚度切片，固定于载玻片。将组织芯片置于二甲苯脱蜡、乙醇再水化，然后双蒸水洗涤。使用高压锅在125℃沸水中抗原修复切片30 s，置于1×DIVA缓冲液中煮沸（125 ℃，30 s），自然冷却20 min以上，至室温，PBS冲洗3次，每次5 min。切片经3%过氧化氢-甲醇液孵育5 min以阻断内源性过氧化物酶活性。PBS冲洗后，正常羊血清工作液37 ℃封闭10 min，倾去勿洗，滴加适当比例稀释的兔抗-SATB1单克隆抗体（1：250；Epitomics），4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3次，每次5 min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）。滴加生物素标记的二抗（Dakocytomation）37 ℃孵育25 min，PBS冲洗。滴加DAB显色2～10 min，显微镜下观察，有棕黄色沉淀物，即自来水冲洗，终止反应。最后，苏木素复染3～5 min，盐酸酒精分化1～2 s，常规脱水，透明，干燥，封片。

三、免疫组化结果判定

使用奥林巴斯DD70BX51采集图像，细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。于高倍显微镜（×400）下，每张切片随机取10个视野，每个视野观察100个细胞，取其平均值。根据染色的强度及切片阳性细胞率判断结果，染色强度：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分和棕褐色为3分；阳性细胞率：无为0分，＜25%为1分，25%～50%为2分，＞50%为3分。上述两项指标相乘后获得总评分0～9分：0分为阴性，1～2分为弱，3～6分为中，7～9分为强。由2个研究者独立进行阅片和评分，总评分为阴性或弱者为弱表达，总评分为中和强的病例为强表达。

四、放疗相关因子的表达

我们以前在本研究使用的这些标本中采用免疫组化染色检测了一些与放疗有一定相关性的指标，包括 Necrosis（n=134）［9］、Ki-67（n=114）［10］、p53（n=134）［11］、p73（n=120）［12］、ATM（n=168）［13］、FXYD-3（n=123）［14］、pRb2/p130（n=80）［15］、MAC30（n=115）［16］、TEM1（n=119）［17］和Survivin（n=89）［18］。

五、网络分析

通 过 Ingenuity通 路 分 析（IPA，Ingenuity®Systems，Mountain View，CA；www.ingenuity.com）评估SATB1的功能重要性。将相互作用基因（包括SATB1）的基因银行ID上传到IPA，然后IPA将其映射至Ingenuity通路知识库（IPKB）中的功能性网络。与整个IPKB进行对比，分配给焦点基因功能的生物学功能构成了网络。

六、蛋白-蛋白相互作用分析

蛋白-蛋白相互作用分析用于发现蛋白质之间的可能相互作用。首先从UniProt数据库下载SATB1（UniProt ID：Q01826），pRb2/p130（UniProt ID：Q08999）和TEM1（UniProt ID：Q9HCU0）的氨基酸序列，然后将这些序列呈递给I-TASSER服务器并下载计算出来的最优模型。C-评分最好在2到-1.5。然后获得的结构在NIH-SAVES服务器上进行验证并呈递给Z-DOCK服务器以获得相互作用模型。在Swiss-PDB阅读器里，每个蛋白和复合物的能量被最小化。最后在Swiss-PDB阅读器中计算出复合物和每个独立链的能量，并从两个蛋白的能量之和中减去复合物能量来评分结合的自由能。从POPS服务器计算每个蛋白和复合物的可及表面积（ASA），然后从每个蛋白ASA之和中减去复合物ASA来计算ΔASA。

七、统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件包进行统计分析，组间率的比较采用卡方检验或确切概率法检验，SATB1与总生存期（overall survival，OS）、无病生存期（disease-free survival，DFS）以及复发的关系采用Cox回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、SATB1在不同组织中的表达情况

在未接受术前放疗的患者中，SATB1从正常组织（16/68；24%）到原发肿瘤（31/74；42%）表达升高（χ2=5.396，P=0.032），而从肿瘤到淋巴结转移（4/27；15%）表达降低（χ2=6.405，P=0.022，图1A）。在接受术前放疗的患者中，SATB1在正常黏膜（12/61；20%）、原发肿瘤（14/68；21%）以及淋巴结转移（3/16；19%）中的表达差异无明显的统计学意义（P＞0.05；图1B）。

图1 SATB1在直肠癌患者中的表达情况。1A：在未接受术前放疗的患者中，SATB1从正常组织到肿瘤表达升高，而从肿瘤到淋巴结转移表达降低（*P＜0.05）；1B：在接受术前放疗的患者中，SATB1从正常组织、肿瘤到淋巴结转移的表达无明显变化

二、SATB1表达与预后的关系

在接受术前放疗的患者中，SATB1的表达与不良的OS（P=0.015）和DFS（P=0.021，图2A、2B）相关，独立于性别、年龄、TNM分期和肿瘤分化程度（OS：HR，0.516；P=0.039；95% CI：0.274～0.969；DFS：HR，0.558；P=0.025；95% CI：0.335～0.930，表2）。然而，SATB1表达与局部复发和远处转移无关（P=0.261，P=0.056；图2C、2D）。在未接受放疗的患者中，单因素及多因素分析均显示SATB1表达与预后无关。这些结果提示SATB1表达可以独立用于预测接受术前放疗直肠癌患者的预后。

三、放疗对肿瘤组织中SATB1表达的影响

与未放疗的直肠癌组织比较，放疗后SATB1表达明显下降（42% vs. 21%，P=0.011）；放疗后SATB1在肿瘤组织中的表达低于术前活检癌组织（40% vs. 20%，P=0.042，图3）。

四、SATB1与放疗相关因子的关系

我们将以前采用相同放疗标本检测的一些放疗有关因子（包括ATM、FXYD-3、MAC30、pRb2/p130、Ki-67、Survivin等）的数据，与SATB1表达进行比较。结果显示在这些放疗的直肠癌患者中，肿瘤组织中SATB1高表达，与ATM和pRb2/p130低表达（χ2=5.427，P=0.032；χ2=4.610，P=0.047），而与Ki-67和TEM1表达均需一致（χ2=4.339，P=0.037；χ2=7.376，P=0.014），见表 3。最后，我们通过Ingenuity通路分析（IPA）分析SATB1与这些放疗相关因子的可能网络关系，显示这些蛋白可能通过一些放疗反应相关的信号通路（图4），比如NF-κB通路、BRCA1介导的DNA损伤反应通路以及细胞周期调控的G1/S检测点通路，从而在放疗反应机制中发挥重要的作用。进一步，我们检测了SATB1蛋白与TEM1和pRb2/p130蛋白的相互作用。结果显示SATB1-TEM1和SATB1-pRb2/p130复合物的ΔASA分别为4513.4 Å2和4286.3Å2，结合自由能分别是-432.18 kcal/mol和-637.482 kcal/mol。在SATB1-TEM1复合物内有8个氢键（图5A），而SATB1-pRb2/p130复合物有17个氢键（图5B）。这些复合物以极性界面为主要特征，表明这些复合物非强制性的结合本质。

图2 接受术前放疗直肠癌患者中SATB1表达与生存和复发的关系。2A：OS；2B：DFS；2C：局部复发；2D：远处转移

表2 接受术前放疗直肠癌患者OS和DFS的多因素分析

讨 论

目前，术前放疗已经作为进展期直肠癌综合治疗的重要组成部分，均推荐对局部晚期直肠癌给予术前放疗［19-20］。术前放疗面临的最大的挑战是进展期直肠癌对放疗的敏感性存在较大的差异，因此找到预测放疗敏感性的标记物可以说是走向直肠癌个体化治疗的关键一步［21］。

SATB1作为染色质高级结构形成的基础，在染色体重塑、转录调节、胸腺发育、T淋巴细胞成熟等方面发挥重要的作用［22-25］。SATB1能将多个远程靶序列固定在“蛋糕样”网络中并使它们聚集在一起，形成染色质环结构，并将染色质重构和转录因子招募给靶基因，从而在T细胞中行使远程的基因表达调控子的功能［25-27］。SATB1能调控超过10%的基因，这些基因的功能复杂多样，从而表明SATB1基因的功能多样性。众多研究证实SATB1与喉癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展和（或）转移有关［3-7］。我们前期的研究结果［8］首次证实SATB1表达与直肠癌的进展有关。本研究中，在未接受术前放疗的患者中，SATB1从正常组织到原发肿瘤表达升高，而从原发肿瘤到淋巴结转移表达降低，显示SATB1在直肠癌发生发展中的作用。

图3 术前放疗对直肠肿瘤SATB1表达的影响 图4 网络分析。SATB1分子网络示意图。在网络中，结代表蛋白，线代表蛋白间的联系。红色的结表示上调，绿色的结表示下调，结的形状代表蛋白的分子类型图5 蛋白-蛋白相互作用分析。5A：SATB1（浅绿色）与TEM1（青色）复合物的可能构象；5B：SATB1（浅绿色）与pRb2/p130（青色）复合物的可能构象；彩球代表氢键

表3 接受术前放疗的直肠癌患者SATB1表达与生物学因子的关系（例，%）

除了在肿瘤中的重要作用外，SATB1在治疗方面的价值，特别是对放化疗的反应性，日益受到人们的关注。DNA是放射线作用的关键靶点，DNA损伤与修复之间此消彼长的动态关系是影响肿瘤放疗敏感性的关键因素。一些DNA损伤和修复相关的基因，也是SATB1调控的靶基因，如DNA损伤诱导转录因子4（DDIT4）、DNA损伤检测点介质1（MDC1）、复制因子C4（RFC4）、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1（PARP1）、TREX2、染色质组装因子1A（CHAF1A）等［28］。SATB1在T细胞中介导DNA损伤位点的装配，SATB1结构体系可在基因调控时为染色质/转录因子的重建提供平台。Li等［29］发现在低剂量X射线所致的DNA损伤时，SATB1能招募DNA修复蛋白，显示其在DNA损伤修复中的重要作用。本研究结果显示在接受术前放疗的患者中，SATB1的表达与这些患者不良的生存独立相关，与局部复发和远处转移无关。提示SATB1表达可以独立用于预测接受术前放疗直肠癌患者的预后。进一步，我们比较了放疗后SATB1的表达变化情况，结果显示与未放疗的直肠癌组织比较，放疗后SATB1表达明显下降；同样，放疗后SATB1在肿瘤组织中的表达明显低于术前活检癌组织。提示在放疗过程中，肿瘤细胞在启动细胞周期阻滞、凋亡、DNA损伤修复等复杂的生物学反应过程中，也出现了SATB1表达的降低，可能在于放疗通过降低SATB1表达触发了其下游调控机制，通过靶基因的调节来介导肿瘤细胞对放疗的反应性。

理论上，放疗可诱导多种多样基因的转录，因此调制基因表达被认为有助于细胞放射反应。这样，放疗诱导的基因表达可构成对放疗的适应性或保护性反应，导致细胞损伤或死亡。因此，我们将以前采用相同标本检测的一些放疗有关因子的数据，与SATB1表达进行比较，以探究SATB1在直肠癌放疗反应中的作用。结果发现，在放疗的直肠癌患者中，肿瘤组织中SATB1的表达与ATM和pRb2/p130表达负相关，而与Ki-67和TEM1表达正相关。近来的研究显示乳腺癌许多与肿瘤发生各个方面有关的基因，包括ATM、Survivin和pRb2/p130，均受SATB1表达的调控。另外，SATB1可直接或间接调控其靶基因，而在肝癌和结直肠癌中这些靶基因与乳腺癌中的许多靶基因相互重叠［30-31］。因此，SATB1在直肠癌中有可能像在乳腺癌中那样影响同一类基因。这些相关的结果指向一个机制，即在放疗中这些基因可能以SATB1-依赖的方式受到调控。随后，我们采用IPA从IPKB构建SATB1调控蛋白的网络，结果证实了SATB1与这些放疗反应蛋白之间的直接相互联系的网络。网络显示这些蛋白可能通过一些放疗反应相关的信号通路，比如NF-κB通路，BRCA1-介导的DNA损伤反应通路以及细胞周期调控的G1/S检测点通路，从而在放疗反应机制中发挥重要的作用。在这些网络中，Ki-67被上调，而ATM和pRb2/p130被SATB1下调，这与我们研究结果中SATB1和这些生物学因子的关系是一致的。另外，网络也显示SATB1通过其他通路上调ATM。在这个网络中，未观察到SATB1与TEM1的直接联系，这可能在于这种关系尚未被报道，而IPA是基于发表文献中的信息来搜索分子间联系的。在一个随机选择基因座（包含SATB1-上调和下调基因）的研究中，所有体内结合SATB1均位于其预测的碱基解配对区，而那些不依赖于SATB1的基因均不与SATB1结合，即使这些基因座有多个碱基解配对区［32］。因此，我们通过蛋白-蛋白相互作用分析来检测SATB1与TEM1和pRb2/p130的相互作用，以验证网络分析中所检测的联系。蛋白-蛋白相互作用预测是一个联合生物信息学和结构生物学的领域，试图证实和分类蛋白对或蛋白组之间的物理相互作用。这些相互作用的信息可提高我们对疾病的认识，并能为新的治疗方法提供理论基础。ΔASA代表复合物和单个分子在水中的差异，为蛋白-蛋白的几何契合提供信息。事实上，高ASA是分子间更高的形态互补的征象。而且，所观察到的自由结合能也支持复合物的稳定形成。这些特征显示SATB1与这些蛋白的结合可能性。虽然这些相互作用仅仅是预测的结果，但本研究中蛋白-蛋白的相互影响是基于共表达、蛋白结构特征和网络拓扑结构数据，这些证据是非常充分的。