MMR与PD-L1在Ⅱ期术后结直肠癌中的差异性表达

刘岩 李慧 赵丹丹 程颖

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是一种发病率高的恶性肿瘤，严重威胁着人类健康，根据中国癌症统计数据，结直肠癌已成为我国发病率及病死率均居第5位的恶性肿瘤，其发病率呈现逐步上升趋势［1-2］。

近年来，分子靶向治疗在某些特定人群中疗效显著，基于生物标志物指导下的靶向药物延长了患者生存并改善了生活质量，细胞程序性死亡配 体 1（programmed cell death ligand 1，PD-L1）和错配修复（mismatch repair def i cient，MMR）基因已经成为免疫靶向药物最重要的生物标志物，Pembrolizumab二线治疗的推荐人群为PD-L1表达≥1%，一线治疗优势患者的PD-L1需≥50%［3-4］，同时也被获批治疗带有MMR缺失（def i cient mismatch repair，dMMR）的实体瘤患者。

肿瘤异质性是导致肿瘤耐药和治疗疗效差异的重要原因之一，肿瘤异质性包括肿瘤间异质性和肿瘤内异质性。为了探讨MMR和PD-L1在同一肿瘤标本中的异质性，本研究分析结直肠癌患者肿瘤组织标本中dMMR和PD-L1的差异性和一致性，为结直肠癌未来免疫靶向治疗的精准诊断提供参考。

材料与方法

一、研究对象

选取2016年1月至2017年10月在吉林省肿瘤医院接受CRC根治性手术的患者50例，手术前均未接受任何治疗，术后病理证实为TNMⅡ期结直肠癌。本研究得到吉林省肿瘤医院伦理委员会批准，患者及家属签署知情同意书。入组患者基本资料：男性27例，女性23例；年龄范围为31～65岁，中位年龄57岁；手术切除新鲜结直肠组织标本后送病理科，以10%福尔马林固定24 h以上，制备石蜡包块。

二、试剂

鼠抗人MutL同源蛋白1（MutL homolog 1，MLH1）、Muts同 源 蛋 白 2（MutS homolog 2，MSH2）、Muts同 源 蛋 白 6（MutS homolog 6，MSH6）、减数分裂后分离蛋白2（Postmeiotic segregation increased 2，PMS2）单克隆抗体、HRP标记兔鼠专用二抗和AEC显色液均购自福建迈新公司，鼠抗人PD-L1单克隆抗体购自cell signaling technology公司，苏木素购自中杉公司，PBS粉末和水性封片剂购自鼎国公司。

三、免疫组织化学

石蜡切片置于65℃干燥箱12 h，脱蜡返水后，采用枸橼酸盐缓冲液（PD-L1）和EDTA缓冲液（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）高压抗原修复2 min，待温度降至室温后，应用3%H2O2常温避光孵育30 min去除内源性过氧化物酶的影响，加入一抗（1:200稀释），湿盒内4℃孵育过夜，PBS洗3遍后加入通用二抗，37℃孵育30 min，最后采用AEC显色，苏木素复染细胞核5 min，封片后在显微镜下观察蛋白染色情况。用已知阳性切片（肺癌）做阳性对照，阴性对照切片用PBS代替一抗。

四、判定标准

MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均定位在细胞核中，当四个错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均表达时，即可判定为错配修复功能完整；四种蛋白中一种以上不表达，判定为MMR表达缺失（dMMR）。判读标准如下：在对照组织（即肿瘤周围的正常上皮细胞、肿瘤内浸润的淋巴细胞、间质细胞均出现细胞核着色）中强阳性表达的前提下，只要MMR蛋白在肿瘤细胞出现核着色，即判定该蛋白为阳性表达；若MMR蛋白在肿瘤细胞未出现核着色则视为MMR蛋白缺失［5-8］。

PD-L1定位于细胞膜和细胞质中，结果判断采用阳性细胞半定量分级法［9］：先根据阳性细胞个数占整个肿瘤细胞的百分率计分，＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；再根据阳性细胞染色深浅计分，不着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，最后将两者分数相乘，0分为阴性，1～4分（＋），5～8分（＋＋），9～12分（＋＋＋），以（＋）及以上表达者即统计为表达阳性。

五、统计学分析

采用SPSS17.0 统计软件进行统计分析，定性资料采用χ2检验，最小频数（T）＜5时采用Fisher精准检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、MMR在Ⅱ期结直肠癌组织中的表达情况

MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均定位在细胞核中（图1），50例CRC组织标本中每种蛋白表达缺失率分别为12%、6%、16%和24%，dMMR的总发生率为32%（16/50），其中，1种蛋白的缺失率占18.7%（3/16）；两种以上蛋白的缺失率所占比例为68.7%（11/16）。

图1 免疫组织化学检测MMR蛋白在结直肠癌组织中的表达。分别于200倍和400倍镜下拍照

二、PD-L1在Ⅱ期结直肠癌组织中的表达

PD-L1阳性可表达于结直肠癌组织的细胞膜或（和）细胞质，呈淡黄色至棕黄色细颗粒（图2A），在50例结直肠癌组织中，PD-L1的阳性率为38%（19/50）；以肺癌组织为阳性对照（图2C）；PD-L1阳性率随年龄增长而增加，分别为24% vs 52%（P=0.041），但与性别、浸润程度和分化程度等临床病理特征均无显著相关性（P＞0.05）（表1）。

三、PD-L1与MMR的一致性及影响因素

PD-L1在dMMR中的表达率为62.5%（10/16），明显高于错配修复功能完整中的表达率26.5%（9/34），差异有统计学意义（P=0.027），见表2；PD-L1在MLH1和MSH2阴性组的表达率高于阳性组，100% vs 34%，83.3% vs 31.8%，P=0.024和0.049，但与MSH6及PMS2蛋白的表达差异则无显著统计学意义（均P＞0.05）；PD-L1与MMR的表达一致性较差（Kappa=0.343，P=0.014）。

图2 免疫组织化学检测PD-L1蛋白在结直肠癌组织中的表达。2A：PD-L1在结直肠癌组织中阳性表达；2B：PD-L1在结直肠癌组织中阴性表达；2C：PD-L1在肺癌组织中高表达（阳性对照）；分别于200倍和400倍镜下拍照

表1 PD-L1表达与Ⅱ期结直肠癌患者临床病理特征的关系

表2 PD-L1在MMR蛋白中的表达情况

讨 论

免疫靶向药物已被美国和欧盟批准用于治疗多种晚期实体肿瘤，如黑色素瘤、肾癌和非小细胞肺癌等，PD-L1的表达状况是目前较多用于临床实践的免疫靶向药物疗效预测标志物［4，10］。多项研究均提示非筛选的晚期结直肠癌患者对抗PD-1/PD-L1治疗效果不佳［11-12］，因此，CRC目前仍需要明确指示药物疗效的生物标志物。

Le等［13］认为 KEYNOTE-028中唯一达到部分缓解的结直肠癌患者可能在基因学方面有着重要特征，并设计了一项以肿瘤基因学特征筛选患者并评估抗PD-1疗效的Ⅱ期临床试验，研究结果提示检测dMMR能够预测患者抗PD-1抗体（pembrolizumab）的预后，该类型患者应用PD1抑制剂的疗效更优。2017年美国FDA依照生物标志物核批的抗肿瘤疗法批准pembrolizumab治疗带有dMMR的实体瘤患者。

肿瘤的瘤内异质性是导致耐药的重要原因之一，当不同的驱动基因表达不一致时，如何优化治疗方案将是未来临床实践的挑战之一。本研究发现Ⅱ期术后的CRC样本中，PD-L1的表达与MMR的一致性低，但是PD-L1与dMMR的阳性人群比例相似，约为30%左右。冯稳等［15］报道210例CRC患者（Ⅰ～Ⅳ期），其PD-L1的总阳性率为18.6%，Ⅱ期患者的阳性率为23%。本研究发现，PD-L1的表达与年龄递增有关（P=0.041），这与Droeser等［14］研究结果一致，他们还认为PD-L1表达可能与结直肠癌淋巴结转移有关，但与性别、分期和浸润程度无关。Siddique等［16］分析1 000余例Ⅰ～Ⅳ期CRC后发现dMMR阳性率为15%～20%，Koopman等［17］认为dMMR的发生率随分期逐步下降，Weiss等［18］认为右半结肠癌及近端结肠癌中dMMR阳性率高。本研究纳入的患者为Ⅱ期患者，dMMR的发生率略高于Ⅰ～Ⅳ期的平均发生率，这可能与入组人群或患者的临床分期相关。

本研究发现dMMR中PD-L1表达率高，而且与MLH1和MSH2蛋白相关。这与Kim等［19］的研究结论一致。他们检测了203例结直肠癌患者，发现PD-L1的阳性表达与MLH1/MSH2缺失密切相关（P=0.01），该结果与本研究的结论一致。

本研究存在一定的局限性，包括缺少免疫靶向治疗对于PD-L1和dMMR差异性和一致性表达患者的治疗疗效数据，此外，该研究方法只是定性检测，缺少更精确的定量分析等。未来同一标本中PD-L1和dMMR的大样本、前瞻性，多平台（既定性又定量）的检测分析将为揭示CRC异质性和靶向基因差异分布的个体化精准治疗和预后提供更多循证医学数据。