羊水间充质干细胞移植改善肺气肿大鼠肺功能及其相关机制研究

吕云 顾超⋆

肺泡结构破坏与丢失、气腔的扩大和肺弹性组织的降解是引起肺气肿或慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者气流受限的重要原因［1］。吸烟是引起肺气肿和COPD的最主要危险因素。如何修复损伤的肺组织，并使丢失的肺泡再生是肺气肿和COPD治疗的关键和难点。目前尚无有效的药物阻止COPD患者肺功能下降。羊水间充质干细胞（AF-MSCs）是羊水干细胞中的一种，具有广泛的分化潜能，能分化为神经细胞、脂肪细胞、骨细胞、心肌细胞等［2-3］。羊水干细胞在合适的龛位环境中可能会整合至特定的组织中并定向分化［4-5］。本课题组前期研究表明，AF-MSCs在体外能通过特定的诱导定向分化为II型肺泡上皮细胞（AECII）［6］。本研究通过AF-MSCs移植入大鼠肺组织中，检测其对肺气肿大鼠肺功能的改善情况及相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 （1）实验动物：清洁级妊娠SD大鼠10只，孕期（13±1）d，体重300～350g，清洁级雄性SD大鼠60只，购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心。本研究经浙江中医药大学实验动物伦理委员会批准。大鼠AF-MSCs由本课题组保存。（2）主要试剂：TRIzol购于美国Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTM II试剂盒购于日本TaKaRa公司；β-actin、兔抗大鼠肺表面活性蛋白SPA及SPC抗体、羊抗兔IgG二抗购于美国Santa Cruz公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒购于江苏碧云天公司；PVDF膜购于美国Bio-Rad公司；eECL高灵敏度化学发光检测试剂盒购于北京康为世纪公司。

1.2 方法 （1）大鼠AF-MSCs分离、培养及鉴定：根据本课题组前期研究方法［6］分离、培养并鉴定大鼠AF-MSCs。（2）肺气肿大鼠模型建立及AF-MSCs移植：将60只清洁级雄性SD大鼠随机平均分为A、B、C、D 4组，每组各15只。A组（正常对照组）、B组（肺气肿组）、C组（AF-MSCs移植30d组）、D组（AF-MSCs移植60d组）；按照本课题组前期方法［7］建立肺气肿大鼠模型，建模时间每周7天，共12周。大鼠建模结束后第2天，C组和D组大鼠用5%异氟醚短暂麻醉大鼠，固定后使大鼠头后仰70°，镊子缓慢夹出大鼠舌头，将静脉留置针的塑料套管插入气管，快速滴入200μl的AF-MSCs悬液（约4×106个细胞），而后注入少量空气以保证全部液体进入气管，将大鼠竖起并适度摇动使药液分布均匀，注意保温，待大鼠清醒后放回饲养笼；而A组和B组大鼠气管内吸入200 μl无菌PBS。（3）大鼠肺功能测定：采用小动物肺功能仪测定各组大鼠肺功能，麻醉消毒后固定，切开颈部皮肤，将气管倒T型切开，食道插管经口插入食道中部，并连接压力传感器记录食道压（即胸腔负压），Y型套管气管插管后，分别连接至微型压力传感器和呼吸流量传感器记录气道压和呼吸流量。观察食道压、气道压和呼吸流量，采集信号良好的波形10 min，通过MPA肺功能分析系统计算并取平均值。（4）肺组织病理学检测：各组大鼠完成肺功能检测后立即用10%水合氯醛腹腔内麻醉处死各组大鼠，对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》标准。取各组大鼠左肺组织蜡块常规切片，行苏木精-伊红（HE）染色，按照本课题组前期方法［7］，肺组织病理半定量分析肺泡平均内衬间隔（mlI）及平均肺泡面积（MAA）。（5）Real-time PCR检测SPA及SPC mRNA水平：收集各组大鼠右肺组织，按照试剂盒说明书合成cDNA，行Real-time PCR，以GAPDH为内参；以2-ΔΔCt分析目的基因相对表达差异。引物序列：SPA正义链5'-TCGGTGTCCCAGGATTTAG-3'，反 义 链 5'-CAGGGTGGCTGCTGTTAGT-3'；SPC正 义 链5'-CAGACACCATCGCTACCTT-3'， 反 义链 5'-TAGCCAAAGCCTCAAGACT-3'；GAPDH 正义链5'-GTTCAACGGCACAGTCAAG-3'，反义链5'-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3'。（6）Western blot检测SPA和SPC蛋白表达：取各组大鼠右肺新鲜肺组织约100 g提取总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度，取含20μg蛋白样品变性后上样至8%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中，常规电泳、转膜及封闭后，加入1：200稀释的兔抗人SPA或SPC抗体孵育，后加入1：2000稀释辣根酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）孵育，最后在UVP-GDS8000凝胶成像分析系统扫描并摄像，图像灰度分析。将各目的蛋白的吸光度值与β-actin内参条带吸光度值的比值作为各蛋白的相对表达量。（7）衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性检测：以染色法检测各组大鼠肺组织SA-β-gal活性，严格按试剂盒说明书操作。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件包。计量资料以（）表示，统计学分析采用方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺功能AR、Cdyn和PEF比较 见表1。

表1 各组大鼠肺功能AR、Cdyn和PEF比较［n=15，（）］

表1 各组大鼠肺功能AR、Cdyn和PEF比较［n=15，（）］

注：与A组比较，*P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05

组别 AR［cm/（ml·s）］ Cdyn（ml/cm） PEF（ml/s）A组 0.134±0.021 0.302±0.025 13.191±1.727 B组 0.334±0.026* 0.174±0.012* 6.796±1.379*C组 0.257±0.027*# 0.200±0.028*# 9.902±3.132*#D组 0.240±0.035*# 0.250±0.031*# 11.304±2.518#F值 43.052 52.232 6.910 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.2 大鼠肺组织病理学改变 各组大鼠肺组织常规HE染色结果显示，B组、C组和D组均出现肺气肿征象：大部分肺泡呈囊状扩张，肺泡腔不规则扩大且大小不一，相同视野内肺泡数目明显减少；部分肺泡间隔断裂，肺泡融合。AF-MSCs移植后肺组织肺气肿改变程度明显减轻，并且移植后60 d（D组）与移植后30 d（C组）比较，肺气肿征象改善更明显，见图1；肺组织病理半定量分析证实B组肺组织mlI和MAA明显高于A组（P＜0.05），而AF-MSCs移植后（C组和D组）大鼠肺组织mlI和MAA明显低于B组（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠肺组织mlI及MAA变化（n=15，）

表2 各组大鼠肺组织mlI及MAA变化（n=15，）

注：与A组比较，*P＜0.05；与B组比较，#P＜0.05

组别 mlI（μm） MAA（μm2）A组 63.56±13.44 4910.78±476.66 B组 120.72± 9.47* 12379.48±1254.63*C组 83.16±9.08# 9850.74±280.60#D组 71.52±10.24 # 8108.74±324.08#F值 27.982 99.140 P值 ＜0.05 ＜0.05

图1 各组大鼠肺组织病理学改变（HE染色，×200）

2.3 大鼠肺组织SPA及SPC mRNA水平分析 Realtime PCR检测各组大鼠肺组织SPA和SPC mRNA表达，结果显示：SPA和SPC mRNA在A组中呈高表达，而在B组中的表达显著降低（P＜0.05）；而AF-MSCs移植后（C组和D组），SPA和SPC mRNA表达明显高于B组（P＜0.05），并且D组表达高于C组。

2.4 大鼠肺组织SPA及SPC蛋白表达水平 Western blot检测各组大鼠肺组织SPA和SPC蛋白表达水平，结果显示：SPA和SPC蛋白在B组中表达显著低于A组（P＜0.05）；AF-MSCs移植后（C组和D组），SPA和SPC蛋白表达明显高于B组（P＜0.05），并且D组表达高于C组；其结果与SPA和SPC mRNA在各组大鼠肺组织中的表达相一致。

2.5 大鼠肺组织SA-β-gal活性改变 以染色法检测各组大鼠肺组织SA-β-gal活性，肺组织中染色成蓝色的细胞为SA-β-gal阳性细胞，即衰老的细胞，大多数位于肺泡角部。与A组比较，B组中SA-βgal阳性细胞明显增多；而AF-MSCs移植后（C组和D组），SA-β-gal阳性细胞减少，且D组减少更明显，见图2。

图2 各组大鼠肺组织SA-β-gal活性改变（×400）

3 讨论

预计到2020年，COPD将是全球死亡原因的第三位因素［8］，在我国＞40岁人群中患病率高达8.2%［9］。COPD发病机制非常复杂，病变累及气道、肺实质和肺血管等结构，呈进行性发展。近年来研究表明，肺泡上皮细胞衰老和细胞凋亡是COPD重要的发病机理［10-12］。越来越多研究表明，细胞衰老在COPD患者中加速，并促进COPD进展［13-14］。目前尚无有效药物阻止COPD患者肺功能长期下降［8］。

哺乳动物的肺泡上皮细胞由I型肺泡上皮细胞（AECI）和AECII组成。AECII不仅可分化为AECI，还可通过有丝分裂补充自身数量；同时AECII还具有合成和分泌肺泡表面活性蛋白、维持肺泡内外液体平衡、免疫调节等作用［6］。肺泡表面活性蛋白包括SPA、SPB、SPC和SPD，其中SPA和SPC是AECII特异性表达的。本研究中，肺气肿大鼠肺功能明显下降，肺组织出现肺气肿征象，包括大部分肺泡呈囊状扩张，肺泡腔不规则扩大且大小不一，相同视野内肺泡数目明显减少；部分肺泡间隔断裂，肺泡融合；并且肺组织中SPA和SPC的mRNA及蛋白表达显著降低。SA-β-gal被认为是细胞衰老的重要生物标记。本研究中，肺气肿大鼠肺组织中SA-β-gal阳性细胞明显增多，提示肺气肿大鼠肺功能的下降和病理学的改变与AECII 的衰老相关。

随着干细胞研究的不断深入，干细胞再生治疗研究也取得突破性进展。De Coppi等［2］首次报道从羊水中分离到具有多向分化潜能的干细胞，羊水作为干细胞新的来源在组织工程学及再生医学方面成为新的研究热点。本课题组前期研究中成功在妊娠大鼠中分离得到AF-MSCs，并证明其在体外能通过特定的诱导定向分化为AECII［6］。过早细胞衰老会显著影响肺部祖细胞功能，使其失去组织修复功能，导致干细胞耗竭、肺组织损伤［13-14］。肺气肿患者内皮细胞端粒长度显著缩短，且肺泡细胞衰老水平与其气流受限程度正相关［10］。本研究中，将AF-MSCs移植入肺气肿大鼠肺组织中后，其肺功能显著好转，肺组织肺气肿征象得到改善，SPA和SPC的mRNA及蛋白表达显著上升，SA-β-gal阳性细胞明显减少，并且AF-MSCs移植60d后上述改善更加明显。

综上所述，AF-MSCs移植能改善肺气肿大鼠肺功能，并促进肺组织修复，其机制可能与AF-MSCs进入肺组织后分泌某些物质来抑制AECII衰老相关，或者与AF-MSCs移植后在肺组织中定植并在适当条件下定向分化为AECII有关。但是，调控AF-MSCs上述功能的信号转导机制有待于进一步研究。