TRPV1基因多态性与肺癌中晚期癌痛患者阿片药物需要量的关系

汪丹 吴成凤 申文

[摘要] 目的 研究瞬時受体电位香草酸亚型1（TRPV1）基因多态性与肺癌中晚期癌痛患者阿片药物需要量的关联性。方法 选择2016年12月～2017年5月在徐州医科大学附属医院住院的肺癌中晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者191例（肺癌组）及健康体检者52名（健康对照组）。收集其外周静脉血标本，采用聚合酶链反应限制性酶切片段多态性（PCR-RFLP）方法对其进行TRPV1基因rs222747、rs8065080两个位点的基因型和等位基因分析，随机选择部分样品应用直接测序法验证其分型结果。采用视觉模拟量表评分法（VAS）对患者进行疼痛评估，应用吗啡当量比较不同基因型患者阿片药物的需要量。 结果 肺癌组和健康对照组TRPV1基因rs222747位点、rs8065080位点均可检出3种基因型：rs222747（CC、GC、GG），rs8065080（CC、TC、TT）。肺癌组与健康对照组rs222747位点的基因型和等位基因分布显示差异无统计学意义（P > 0.05），而肺癌组与健康对照组rs8065080位点的基因型和等位基因分布显示差异有统计学意义（P < 0.05）。肺癌组rs222747位点各基因型和等位基因患者的阿片药物日均需要量、体重标化日均需要量、体重表面积标化日均需要量差异均无统计学意义（P > 0.05）。 结论 尚不能认为TRPV1基因rs222747位点基因多态性与肺癌中晚期癌痛患者阿片药物需要量有关。

[关键词] 瞬时受体电位香草酸亚型1；基因多态性；肺癌；癌痛

[中图分类号] R730.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）09（a）-0087-04

[Abstract] Objective To investigate the relationship between transient receptor potential vanilloid 1 （TRPV1） gene polymorphisms and opioid requirements in patients with advanced lung cancer. Methods Peripheral venous blood samples were collected from 191 patients with advanced lung cancer （stages Ⅲ and Ⅳ） （lung cancer group） and 52 healthy controls （healthy control group） in Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University from December 2016 to May 2017. The genotypes of rs222747 and rs8065080 of TRPV1 were analyzed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP）. Part of samples were randomly selected and verified by direct sequencing method. Visual analogue scale （VAS） was used to evaluate the pain of patients and morphine equivalents were used to compare the requirements of opioids for patients with different genotypes. Results Three genotypes were detected in lung cancer group and healthy control group： rs222747 （CC， GC， GG） and rs8065080 （CC， TC， TT）. There was no significant difference in the genotype and allele distribution of rs222747 between the lung cancer group and healthy control group （P > 0.05）. The distribution of genotypes and alleles of the rs8065080 between the lung cancer group and the healthy control group were statistically significant（P < 0.05）. There was no significant difference in the 24 h-opioids doses， weight-adjusted-24 h-opioids doses， weight-surface area-adjusted-24 h-opioids doses between the genotypes and alleles of rs222747 in the lung cancer group with pain（P > 0.05）. Conclusion There is insufficient evidence that the rs222747 polymorphisms of TRPV1 are associated with the requirement of opioids in advanced lung cancer patients with pain.

[Key words] Transient receptor potential vanillic acid subtype 1； Gene polymorphism； Lung cancer； Cancer pain

在全球范围内，诸多癌症患者正饱受疼痛的煎熬。疼痛的影响因素有很多，包括生理、认知、情绪和基因等方面[1]。疼痛感知的个体差异在癌症病人中表现尤为突出[2]，其中基因因素是引起这种差异的重要原因[3]。目前，癌痛的药物治疗均采用WHO癌症疼痛三阶段治疗原则，但阿片类药物的长期使用会导致嗜睡、便秘、恶心呕吐、呼吸抑制、耐受性和成瘾性等副作用[4]。阿片类药物的镇痛效果以及不良反应除了与个体药代动力学有关，遗传因素也同样发挥重要作用。研究发现，携带ABCB1 3435TT基因型、TT单倍体的患者对阿片类药物治疗效果较佳，所需药物剂量较低[5]。

TRPV1属于瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）家族中的TRPV（vanilloid）亚家族，高表达于三叉神经节（TG）、背根神经节（DRG）等的外周和中枢小直径感觉神经元末端[6]。研究发现，TRPV1基因rs8065080位点C-T突变以及rs222747位点C-G变或变异在蛋白水平上可导致氨基酸的改变[7]，使其表现的性质发生改变。本研究即选取TRPV1基因rs222747、rs8065080位点，探索TRPV1基因多态性与肺癌中晚期癌痛患者阿片药物需要量的关系。

1 对象与方法

1.1研究对象

选择2016年12月～2017年5月徐州医科大学附属医院（以下简称“我院”）肺癌中晚期（Ⅲ、Ⅳ期）患者191例作为肺癌组，选择同期我院体检中心健康对照者52名作为健康对照组。本研究经我院医学伦理委员会批准，且入组患者或其家属均已知情同意并签署知情同意书。癌症患者病例按照2012年发表在中国肺癌杂志上的《原发性肺癌诊疗规范》的标准[8]。纳入标准：①按上述标准确诊为肺癌中晚期患者；②未接受化疗者；③性别不限，年龄18～80岁；④神志清楚，无交流障碍。排除标准：①患有严重精神疾病或神志不清者；②患有严重心、脑血管疾病，肝、肾功能严重损害者；③有酒精成瘾或药物滥用史；④患有中枢神经系统、胃肠道疾病者；⑤合并有其他慢性疼痛患者；⑥阿片耐受者。

肺癌组男125例，女66例，平均年龄（62.38±10.96）岁；健康对照组男27名，女25名，平均年龄（59.13±10.35）岁；两组性别构成比、年龄比较，差异无统计学意义（P = 0.07、0.06），具有可比性。

1.2 方法

应用视觉模拟量表评分法（VAS）[9]对患者进行疼痛评估。应用吗啡当量进行药物剂量的比较，见表1。本研究中所应用阿片药物需求量的计算方法主要有3种：24 h-阿片剂量、体重-24 h-阿片剂量、体重-体表面积-24 h-阿片剂量[10]。

1.2.1 基因组DNA的提取 入组患者采集EDTA抗凝的外周静脉血，采用DNA提取试剂盒法分别进行血液基因组DNA（上海赛百盛基因技术有限公司）的提取。

1.2.2 引物 PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，rs222747位点：上游引物5′-CAGAGACAGAGGGAGTTTGGA-3′，下游引物5′-ACACA-CAGATAGCGACGCCA-3′；rs8065080位点：上游引物5′-CAAGTCCTGGAGCTCATTTCA-3′，下游引物5′-GCCCTGACCCAGGTATGTGTA-3′。两位点上、下游引物均由上海生物工程公司合成，-20℃保存，引物使用前稀释成10 μmol/L。

1.2.3 PCR 扩增 PCR扩增应用PCR扩增仪，反应体系：浓度为10 μmol/L的上下游引物各1 μL，2×PCR mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。依次进行：95℃预变性4 min；95℃变性30 s，62℃退火30 s（rs8065080退火温度为57℃），72℃延伸30 s，35個循环；72℃再延伸10 min。rs222747、rs8065080位点的PCR扩增目的基因产物长度分别为487、486 bp。

1.2.4 限制性片段长度多态性分析 TRPV1基因rs222747位点的PCR产物限制性酶切反应体系为50 μL：10×NEB 缓冲液5 μL，PCR 扩增产物10 μL，限制性内切酶BsaBI（上海生物工程公司）1 μL，灭菌水34 μL，65℃暖烘箱2 h，2%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker（DL50 bp）为参照，在凝胶成像系统下观察并判断基因型（rs8065080位点限制性内切酶Hpy99I，烘箱1 h）。PCR产物电泳结果显示PCR反应扩增产物与目的片段长度相符。见图1。

1.2.5 PCR-RFLP 的方法学验证 在试验结果中分别随机抽取部分用PCR-RFLP方法得出的rs222747、rs8065080位点突变杂合子、野生纯合子、突变纯合子PCR扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司进行测序验证。见图2。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，正态分布的计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料用四分位数间距（P25，P75）表示；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组TRPV1基因 rs222747和rs8065080位点的基因型与等位基因分布

肺癌组与健康对照组TRPV1基因rs222747位点的基因型和等位基因分布显示差异无统计学意义（P > 0.05），见表2。rs8065080位点的基因型和等位基因分布显示，差异有统计学意义（P < 0.05），见表3。因不能排除其与肺癌癌症的关系，故不予进行肺癌疼痛组rs8065080位点的基因多态性与阿片药物需要量关系的下一步研究。

2.2 TRPV1 rs222747位点基因多态性对肺癌中晚期患者阿片药物需要量的影响

肺癌组患者的基本资料比较显示不同基因型及等位基因患者年龄、性别、肿瘤分期比较差异无统计学意义（P > 0.05），见表4。不同基因型及等位基因型患者阿片药物需要量比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表5。即尚不能认为TRPV1基因rs222747位点的基因多态性对肺癌中晚期患者阿片药物需要量有影响。

3 讨论

在癌痛的形成因素中，伤害性感受器发挥着极其重要的作用。其中，两个主要类型是无髓鞘的C纤维以及有髓鞘的Aδ纤维[11]。这些神经纤维通过将化学信号转化为电信号并形成动作电位，从而将有害的信息迅速传至大脑。在这个过程中，阳离子通道如瞬时受体电位（TRP）通道已经被确定为主要疼痛受体[12]。

随着人们对基因研究的深入，一些与疼痛密切相关的基因逐渐被认知，以阳离子通道SCN9A[13]、TRPV1[14]、阿片受体基因OPRM1[15]、转运蛋白P-gp[16]、药物代谢酶儿茶酚O-甲基转移酶COMT[17]、炎性因子白细胞介素-1[18]等居多。Gong等[10]研究发现，在ABCB1 C3435T各基因型中，TT基因型患者的体重-表面积标化阿片药物日均需要量要少于CC/CT基因型患者。本研究比较分析肺癌组中TRPV1 rs222747位点不同基因型及等位基因患者其阿片药物日均需要量、体重标化日均需要量、体重-体表面积标化日均需要量的差异，结果均显示差异无统计学意义（P > 0.05）。免疫组化显示在背根神经节（DRG）细胞中μ和δ阿片受体TRPV1共区域化[19]，阿片样物质和TRPV1相互作用的胞内调节器可能为蛋白激酶A（PKA），PKA可敏化TRPV1并增强DRG神经元中的TRPV1电流[20]，而阿片类药物可抑制环腺苷单磷酸（cAMP）形成和PKA活化，从而减弱TRPV1介导疼痛的作用。

分析本研究结果考虑有以下两方面原因：第一，TRPV1 rs222747位点上单个核苷酸的改变可能并未引起通道功能的改变；第二，癌痛患者阿片药物需要量可能还与患者疼痛程度有关。基因多态性与阿片药物的镇痛效应之间的关系很复杂，可能受种族、环境、疼痛类型、疾病严重程度以及基因相互作用等方面因素的影响，选取单一的SNP位点改变代表TRPV1基因多态性对阿片药物需要量进行分析尚不全面，选取位点、多个基因相互作用及其单倍体分析进行研究会更全面、更有意义。

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（收稿日期：2018-04-02 本文編辑：任 念）