IL-17A通过上调ABCA1的表达减少RAW264.7巨噬细胞脂质的积聚*

马望歌， 周 栋， 王丽君， 刘 艳， 陈小莉， 郭 宁， 周 娟△

(1西安交通大学第一附属医院心血管内科， 陕西 西安710061; 2汉中市中心医院心血管内科， 陕西 汉中 723000)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病的重要致病因素之一，且已被认定为一种慢性炎症性疾病[1]，AS的进展与动脉壁的炎症及免疫反应息息相关。在AS进程中，巨噬细胞可以通过摄取氧化修饰的低密度脂蛋白引起胞内脂质堆积，并转变为泡沫细胞，从而最终在AS的形成过程中发挥着重要的推动作用[2]。巨噬细胞膜上的三磷酸腺苷结合盒转运体 A1(adenosine triphosphate binding cassette transporter A1，ABCA1)[3]可以介导细胞内脂质的流出，维持细胞脂质稳态，因而是体内重要的抗AS的蛋白之一。

已证实在AS斑块中存在水平较高的白细胞介素家族新型细胞因子白细胞介素17A(interleukin-17A, IL-17A)[4]，但其在AS发展进程中的作用尚存争议。有文献报道IL-17A具有一定的抗AS作用[5]，但机制不清。本研究旨在探索细胞因子IL-17A对RAW264.7巨噬细胞ABCA1表达的影响，进而明确IL-17A在AS进程中的作用及其发生机制。

材 料 和 方 法

1 试剂

RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞库。DMEM 培养基购自HyClone；胎牛血清购自Gibco；TRIzol购自Invitrogen；逆转录试剂盒购自Fermentas；SYBR Green实时定量PCR试剂盒购自TaKaRa；RIPA 裂解液购自碧云天生物有限公司；抗ABCA1抗体购自Novus；抗β-actin抗体购自Cell Signaling Technology；引物由上海生工公司合成；其它试剂均为国产分析纯。

2 主要方法

2.1细胞培养 RAW264.7细胞常规培养于含10%胎牛血清的DMEM基本培养基中，5% CO2、37 ℃孵箱培养。2～3 d换液 1 次，待细胞长满后进行胰酶消化、传代。取生长状态良好的细胞种植于6孔板中。细胞干预处理前，使用无血清培养基饥饿细胞18～24 h。

2.2细胞干预方法 本实验中，我们根据具体情况分别给予终浓度为0、10、20和50 μg/L的IL-17A进行干预6和24 h，再检测ABCA1的mRNA和蛋白表达水平；在时间梯度实验中，我们给予终浓度为20 μg/L的IL-17A分别干预细胞1、3、6、12及24 h，并检测ABCA1的mRNA和蛋白表达水平。

2.3Western blot实验 吸尽培养基，预冷PBS漂洗2次，加入蛋白裂解混合液(RIPA)裂解细胞，并提取蛋白进行蛋白定量。采用SDS-PAGE分离等量蛋白，将其转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭后加入I抗孵育、4 ℃过夜，孵育 II 抗后化学发光法显色。β-actin作为内参照。

2.4RT-qPCR实验 提取细胞总RNA，逆转录为 cDNA，RT-qPCR进行扩增。ABCA1的正向引物序列为5’-GCGGCAACAAACGAAAGCTC-3’，反向引物序列为5’-GGCACCTGAACCTTCCATTG-3’；β-actin的正向引物序列为5’-GTGACGTTGACATCCGTAAA-3’，反向引物序列为5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACA-3’。PCR扩增条件为: 95 ℃预变性10 s； 95 ℃变性5 s、56 ℃退火20 s、72 ℃延伸10 s，共40个循环。读取样本中 ABCA1 和 β-actin的Ct值。β-actin作为内参照，目的基因相对表达量采用2-ΔΔCt法进行计算。

2.5NBD-胆固醇流出测定 取对数生长期的RAW264.7细胞，在含0.5% FBS的DMEM 中分别加入20 μg/L IL-17A或等体积ddH2O培养18 h，而后加入NBD-胆固醇(1 mg/L)孵育6 h，PBS 漂洗2次后，2组分别加入含 0.2% BSA的DMEM及载脂蛋白A1(apolipoprotein A1,ApoA-1; 15 mg/L)+0.2% BSA，收集细胞上清并裂解细胞，在Victor X多标记酶标仪上读取荧光强度值并进行分析。

2.6油红O染色细胞内脂质含量的测定 将RAW264.7细胞培养在放置有消毒盖玻片的6孔培养板内, 细胞经IL-17A干预处理后, 再加入ox-LDL 30 mg/L继续孵育8 h， PBS洗3次，4%多聚甲醛室温下固定30 min，油红O工作液染色15 min，苏木素染色30 s，甘油明胶封片后，光学显微镜下观察细胞内的脂滴含量。

3 统计学处理

统计软件采用SPSS 18.0，数据以均数±标准误(mean±SEM)表示，数据统计以单因素方差分析检验方法进行多组间比较，组间差异比较用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。图表绘制采用GraphPad Prism 5.0软件。

结 果

2.1 RAW264.7巨噬细胞的一般情况观察

RAW264.7细胞呈扎堆生长，正常的状态是成片地生长，并会叠加成层。生长状态良好的细胞RAW264.7细胞刚贴壁时呈圆形，折光度很好，镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变为类似四角形或多边形，同时伸出伪足，见图1。

2.2 IL-17A可以增加RAW264.7巨噬细胞ABCA1蛋白的表达

与未经IL-17A干预的细胞相比，给予20 μg/L的IL-17A干预1 h、3 h、6 h、12 h和24 h，RAW264.7巨噬细胞的ABCA1蛋白表达显著增加，在6 h时达到峰值，24 h时仍然保持较高水平(P<0.05),见图2。

Figure 1.Observation of RAW264.7 macrophage growth under microscope (×40).

我们进一步给予浓度为10、20和50 μg/L的IL-17A分别干预RAW264.7细胞6 h及24 h，结果显示，细胞ABCA1蛋白的表达水平均随干预浓度的增加而升高(P<0.05)，见图3。

Figure 2.The protein expression of ABCA1 in the RAW264.7 macrophages treated with IL-17A at 20 μg/L for different time. Mean±SEM. n=5. * P<0.05 vs 0 h.

Figure 3.The protein expression of ABCA1 in the RAW264.7 macrophages treated with IL-17A at different doses for 6 h (A) and 24 h (B). Mean±SEM. n=3～4. *P<0.05 vs 0 μg/L.

3 IL-17A可以增加RAW264.7巨噬细胞ABCA1蛋白的含量，但不影响其mRNA的表达

为了探究IL-17A增加巨噬细胞ABCA1蛋白表达的分子机制，我们进一步检测IL-17A干预条件下细胞ABCA1的mRNA表达水平。RT-qPCR结果示，与对照组相比，给予浓度为10、20和50 μg/L的IL-17A干预RAW264.7细胞1 h、3 h和6 h，ABCA1的mRNA表达水平均无显著变化，见图4。

4 IL-17A可以增加RAW264.7巨噬细胞ApoA-1介导的胆固醇流出

我们进一步测定了由IL-17A介导的ABCA1蛋白表达增加对巨噬细胞胆固醇流出的影响，正常对照组细胞在加入NBD-胆固醇后，其流出率约为20%，而当20 μg/L的IL-17A与细胞共孵育18 h，细胞NBD-胆固醇的流出率大幅增加(P<0.05)，见图5。

5 IL-17A可以减少巨噬细胞ox-LDL的积聚

为了观察IL-17A增加巨噬细胞ABCA1蛋白的表达是否会影响细胞脂质的积聚，我们将RAW264.7细胞与ox-LDL共同孵育，同时采用油红O染色法检测细胞脂质含量。结果显示，与对照组相比，ox-LDL与细胞共孵育可以明显增加细胞内的脂质含量，但IL-17A预处理却可以显著降低细胞脂质含量，见图6。

Figure 4.The mRNA expression of ABCA1 in the RAW264.7 macrophages treated with IL-17A at different dose for 1 h (A), 3 h (B) and 6 h (C). Mean±SEM. n=3.

Figure 5.The cholesterol efflux to ApoA-1 of RAW264.7 macrophages treated with or without IL-17A. Mean±SEM. n=3. *P<0.05 vs control group.

讨 论

AS是心血管疾病的重要致病因素之一，是冠心病的主要病因，而巨噬细胞所形成的泡沫细胞[6]又是AS的主要病因。在AS中，巨噬细胞脂质代谢的紊乱，吞噬超负荷脂质，引起泡沫化是AS进程中至关重要的一步，促使泡沫细胞内脂质外流即胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport，RCT)[7]对防治AS具有重要意义。研究证实，外周组织细胞与胞外胆固醇受体之间至少有3种胆固醇流动途径[8]：(1)细胞内外胆固醇水相扩散；(2)SR-BI介导的双向被动转运；(3)ABCA1与ABCG1介导的单向主动转运，其中ABCA1和ABCG1介导的单向胆固醇流出是外周组织胆固醇流出的主要途径。ABCA1主要介导细胞内胆固醇流出至ApoA-1，它可有效减少外周组织脂质的蓄积。

Figure 6.Lipid accumulation in the RAW264.7 macrophages treated with or without IL-17A (×40).

现今，IL-17A在动脉粥样硬化中的作用还具有较大争议[5]。有研究证实，IL-17A的表达在人群及小鼠的AS斑块病损区显著增多[9]，在给予小鼠IL-17A中和抗体后，AS的严重程度得到了明显的改善，提示IL-17A在AS斑块的形成中具有促进作用；但另一方面，有资料显示高脂饮食所诱导的载脂蛋白E基因敲除的AS小鼠模型，结果发现蜂胶乙醇提取物可使该小鼠模型IL-17A表达水平增高进而表现出AS病变明显被抑制。本研究从IL-17A入手，重点探讨其对巨噬细胞ABCA1表达的影响。我们的研究证实，IL-17A可以增加RAW264.7巨噬细胞胆固醇代谢关键性因子ABCA1蛋白的表达。胆固醇逆向转运是机体内排出过多胆固醇的唯一途径，对维持生物体胆固醇代谢的稳态具有重要意义。胆固醇的逆向转运也被认为是机体抗动脉粥样硬化的关键步骤之一。ABCA1可以促进胞内胆固醇和磷脂的流出，随后与细胞表面apoA-I相结合，最终形成新的HDL[10]。我们的研究表明IL-17A可以增加RAW264.7巨噬细胞ABCA1的表达，说明IL-17A可能具有一定的抗AS作用，这一作用可能与其促进巨噬细胞脂质的逆向运输，从而抑制巨噬细胞的泡沫化，阻碍泡沫细胞的形成有关(这一作用在我们的油红O染色实验中也得到了初步的证实)。有关IL-17A促进ABCA1表达的具体机制，我们的实验也进行了初步的探讨。结果表明，IL-17A不影响ABCA1的mRNA表达水平，说明IL-17A并不是通过增加ABCA1基因的转录而促进其表达的。那么，IL-17A是否会通过减少ABCA1蛋白质的降解从而促使其表达升高？我们也将在后续的实验中进一步证实。

本实验结果表明，IL-17A可以增加RAW264.7巨噬细胞ABCA1蛋白的含量，但却不影响其mRNA的表达水平。IL-17A可以减少RAW264.7巨噬细胞内脂质的积聚从而抑制泡沫细胞的形成，这一作用可能与其具有一定的抗AS效能有关。