KLF4对结直肠癌细胞生长抑制及化疗敏感性的影响*

杨 洲， 刚海菊， 覃先蓬， 贾贵清， 王 波， 杨 春， 赵高平

(1四川省医学科学院·四川省人民医院胃肠外科, 2成都职业技术学院医护分院， 四川 成都 610000)

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，近年的总体发病率呈现出上升的趋势，且大部分患者在确诊时已发生转移，能够接受根治性手术的患者，亦有半数最终发生远处转移,因此，大多数患者需进行术后化疗[1-2]。铂类是结直肠癌化疗常用的药物，顺铂(cisplatin)在铂类中有较广泛的应用，但具有一定的毒副作用，因此提高结直肠癌对顺铂的化疗敏感性备受研究者关注。Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)是Krüppel样因子家族中的一个成员，人KLF4基因定位于9q31，具有调节细胞增殖、凋亡、分化及维持机体组织稳态等多种重要的功能，在恶性肿瘤的发生发展中可能发挥癌基因或抑癌基因样作用，如在结直肠癌、肺癌等肿瘤中具有抑癌样作用，而在口腔鳞癌等肿瘤中表达升高，发挥促癌样作用[3-5]。有研究发现抑制骨肉瘤中KLF4的表达可增加顺铂对肿瘤的化疗敏感性[6]；重组人KLF4可以提高肝癌细胞的顺铂化疗耐受性[7]。目前已证实，KLF4是消化道上皮的重要抑癌基因[8-9]，但其对结直肠癌生物学特性及是否可增加顺铂化疗敏感性还未清楚。本研究通过过表达KLF4，检测其对结直肠癌细胞活力、凋亡及顺铂化疗敏感性的影响，并探讨其可能的分子机制。

材 料 和 方 法

1 主要试剂和仪器

胎牛血清购自Gibco；RPMI-1640培养基购自HyClone；脂质体LipofectamineTM2000购自Invitrogen； CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；膜联蛋白V-FITC/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)细胞凋亡试剂盒购自南京凯基；Bradford试剂盒购自上海生工；抗KLF4、p-IκBα、细胞周期素D1(cyclin D1)和生存素(survivin)抗体均购自Santa Cruz。MK3酶标仪(Thermo)；Bio-Plex200流式细胞仪(BioRad)。

2 方法

2.1细胞培养 人结肠黏膜上皮NCM460细胞及结直肠癌Caco2、SW480和HCT116细胞均购自中国科学院上海细胞库。细胞在37 ℃解冻后，置于5%体积分数的CO2培养箱中用含有10%小牛血清的RPMI-1640培养基培养。选择对数生长期的细胞用于实验研究。

2.2pcDNA3.1-KLF4转染SW480细胞 细胞转染分为对照(control)组(仅加入脂质体)、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1空质粒)和pcDNA3.1-KLF4组(转染构建的pcDNA3.1-KLF4过表达质粒)，转染方法参照LipofectamineTM2000产品说明书进行瞬时转染。转染前1 d接种SW480细胞(每孔2.5×105)于6孔板，每孔加入1 mL，细胞生长融合达60%～75%时，更换培养液(不含血清及抗生素)，按照上述分组参照转染说明进行转染，转染后培养箱内培养5～6 h，换为含血清和无抗生素培养液，继续培养48 h，Wes-tern blot检测各组细胞中KLF4的表达。

2.3Western blot实验 在生长至对数期的NCM460、Caco2、SW480、HCT116细胞及各处理组的SW480细胞中加入适量的RIPA细胞裂解液，于冰上裂解反应30 min，离心收集上清液，上清即为提取的总蛋白，Bradford法检测蛋白浓度。总蛋白变性处理后取50 μg上样，SDS-PAGE分离蛋白后通过半干转印法转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温条件下封闭转好的PVDF膜1 h，洗膜，4 ℃摇床孵育皆按照1∶1 000稀释的抗KLF4、p-IκBα、cyclin D1和survivin抗体过夜，洗膜，加入HRP标记的山羊抗兔 II 抗，ECL发光剂显影，扫描胶片后用图像分析软件测定各蛋白条带的灰度值，以GAPDH作为内参照计算KLF4、p-IκBα、cyclin D1和survivin的相对蛋白量。

2.4CCK-8法检测细胞活力 以每孔5 000个细胞接种生长至对数期的SW480细胞于96孔板，培养箱内常规培养24 h进行同步化处理，将pcDNA3.1-KLF4和pcDNA3.1转染SW480细胞，并设置空白对照组，每组均设置5个平行孔，转染方法同2.2，转染48 h后吸出培养基，pcDNA3.1-KLF4组加入1 mg/L顺铂，，实验分为pcDNA3.1、pcDNA3.1-KLF4和pcDNA3.1-KLF4+顺铂，顺铂处理48 h后，在各组的每孔细胞中加入CCK8试剂10 μL，酶标仪测定450 nm处吸光度(A)值。实验重复3次。

2.5流式细胞术检测细胞凋亡率 采用Annexin V-FITC和PI双染法。消化收集参照2.4分组处理的3组细胞，预冷的PBS洗涤细胞，binding缓冲液重悬细胞，分别加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，室温避光环境反应10～15 min，流式细胞仪进行检测。实验重复3次。

2.6活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)含量的检测 PBS洗涤参照2.4分组处理的3组细胞，悬浮细胞于含有终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA的无血清培养液中，培养箱37 ℃避光条件孵育1 h，孵育完毕用不含血清培养基洗涤细胞，将细胞悬液浓度调整为2×108，取10 μL细胞悬液加到载玻片上，盖片。将玻片固定在激光共聚焦显微镜载物台上，荧光显微镜下观察细胞形态及细胞内DCF荧光分布及强度变化。实验重复3次。

3 统计学方法

所有实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 结直肠癌细胞中KLF4的表达

Western blot检测结果显示，与人正常结肠NCM460细胞相比，结直肠癌Caco2、SW480和HCT116细胞中KLF4的蛋白表达均显著降低(P<0.05),见图1。

Figure 1.The protein expression of KLF4 in the colorectal can-cer cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs NCM460 cells.

2 pcDNA3.1-KLF4转染SW480细胞的效果

pcDNA3.1组KLF4的蛋白表达与对照组差异无统计学意义， pcDNA3.1-KLF4组KLF4的蛋白表达显著高于对照组(P<0.05),见图2。

Figure 2.The effect of pcDNA3.1-KLF4 transfection on the expression of KLF4 in the SW480 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group.

3 转染pcDNA3.1-KLF4增加顺铂对SW480细胞活力的抑制作用

以A值反映细胞活力，间接反映出细胞的增殖能力，CCK8法检测结果显示，pcDNA3.1-KLF4组的细胞活力显著低于pcDNA3.1组(P<0.05)，而pcDNA3.1-KLF4+顺铂组的细胞活力显著低于pcDNA3.1-KLF4组(P<0.05)，见图3。

Figure 3.Transfection of pcDNA3.1-KLF4 increased the inhibitory effect of cisplatin on the viability of SW480 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group; #P<0.05 vs pcDNA3.1-KLF4 group.

4 转染pcDNA3.1-KLF4增加顺铂对SW480细胞凋亡的促进作用

pcDNA3.1-KLF4组的细胞凋亡率显著高于pcDNA3.1组(P<0.05)，而pcDNA3.1-KLF4+顺铂组的细胞凋亡率显著高于pcDNA3.1-KLF4组(P<0.05)，见图4。

Figure 4.Transfection of pcDNA3.1-KLF4 increased cisplatin-induced apoptosis of SW480 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group; #P<0.05 vs pcDNA3.1-KLF4 group.

5 转染pcDNA3.1-KLF4增加顺铂促进SW480细胞生成ROS的作用

细胞内的ROS水平与检测的荧光强度呈现出正相关。pcDNA3.1-KLF4组的ROS含量显著高于pcDNA3.1组(P<0.05)，而pcDNA3.1-KLF4+顺铂组的ROS含量显著高于pcDNA3.1-KLF4组(P<0.05)，见图5。

6 转染pcDNA3.1-KLF4对顺铂处理的SW480细胞p-IκBα、cyclin D1和survivin蛋白水平的影响

Western blot检测各组细胞中NF-κB信号通路关键分子IκBα的磷酸化水平及下游蛋白cyclin D1和survivin的表达，结果显示, pcDNA3.1-KLF4组的p-IκBα蛋白水平显著高于pcDNA3.1组，cyclin D1和survivin的蛋白水平显著低于pcDNA3.1组(P<0.05)；而pcDNA3.1-KLF4+顺铂组的p-IκBα蛋白水平显著高于pcDNA3.1-KLF4组，cyclin D1和survivin的蛋白表达显著低于pcDNA3.1-KLF4组(P<0.05)，见图6。

讨 论

多项研究显示，一些信号转导通路、原癌基因和抑癌基因等与结直肠癌的化疗敏感性密切相关，并取得了一定的成果[10-12]，但结直肠癌发生发展的确切机制还未清楚。KLF4在肿瘤中具有双向功能，有癌基因或抑癌基因样作用，与肿瘤的发生发展、侵袭转移、预后等有密切联系[13]。有研究显示，肺癌中敲减KLF4的表达可促进癌细胞的生长，而过表达KLF4可抑制癌细胞的生长[14]；过表达KLF4的白血病细胞生长受到抑制，凋亡增加[15]。目前也有多项研究证实KLF4参与胃肠道肿瘤形成，有研究显示，胃癌中KLF4表达水平降低，其表达与胃癌的分化程度及进展呈现出正相关，可促进胃癌增殖[16-17]；结肠癌中过表达KLF4可抑制癌细胞生长和侵袭，并诱导细胞凋亡，将过表达KLF4基因种植到裸鼠体内，也可明显降低肿瘤大小[18-19]。因此，KLF4表达可作为胃癌和结肠癌预后判断的一项独立指标。结直肠癌中KLF4是否可增强化疗敏感性还未明确。

Figure 5.The effect of pcDNA3.1-KLF4 transfection on the content of ROS in the SW480 cells treated with cisplatin (×200). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group; #P<0.05 vs pcDNA3.1-KLF4 group.

本研究发现结直肠癌细胞中KLF4的表达均明显降低，这与前人的研究结果是一致的，提示KLF4对结直肠癌的负向调控作用。将过表达KLF4质粒转染结直肠癌SW480细胞，发现过表达KLF4后结直肠癌细胞的活力受到抑制，凋亡增加，且可增加顺铂对结直肠癌活力的抑制和凋亡的促进作用。这提示过表达KLF4可增加顺铂对结直肠癌的顺铂化疗敏感性。

ROS可通过内质网及线粒体途径引起细胞的凋亡，是细胞发生凋亡的重要促进因子。低水平ROS可参与调节细胞的正常生理功能，而细胞内大量的ROS的积聚可引起细胞的凋亡[20-21]。有研究显示，结直肠癌中ROS水平参与了癌细胞的凋亡[22]。NF-κB可参与肿瘤、免疫等过程，大多数情况下NF-κB是无活性状态，当受到刺激后，可引起IκBɑ发生磷酸化，磷酸化的IκBɑ与NF-κB分离，NF-κB游离出来而释放入核而后行使转录因子功能，诱导一些靶基因的表达，如cyclin D1、survivin、Bcl-2等[23-24]。有研究显示，异常活化的NF-κB与一些肿瘤的浸润转移存在密切关系[25-26]。结直肠癌中NF-κB的含量增多，其表达与肿瘤分期、淋巴结转移等相关，异常活化的NF-κB信号可促进结直肠癌的发生和转移。但也有研究发现抑制NF-κB信号可降低结直肠癌的发生发展[27-28]。过表达KLF4是否可通过调节NF-κB信号影响结直肠癌发生发展还未清楚。本研究结果显示，过表达KLF4后ROS含量明显升高， IκBɑ的磷酸化水平升高，并可抑制靶基因cyclinD1和survivin的表达，提示KLF4对结直肠癌细胞活力和凋亡的影响可能与提高细胞内ROS含量及抑制NF-κB信号通路有关。

综上所述，上调结直肠癌细胞KLF4基因表达可降低癌细胞活力、诱导细胞凋亡及增加顺铂化疗敏感性，其机制可能与提高细胞内ROS含量及下调NF-κB信号通路有关。该研究可能为结直肠癌治疗提供了新的途径，但还需更多研究理论及临床试验证实。

Figure 6.The effect of pcDNA3.1-KLF4 transfection on protein levels of NF-κB signaling pathway-related molecules in the SW480 cells treated with cisplatin. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pcDNA3.1 group; #P<0.05 vs pcDNA3.1-KLF4 group.