跨代饲喂转maroACC基因玉米对子代蛋鸡肠道发育和形态的影响

■张立兰 钟儒清 陈 亮 张宏福

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

自1996年出现转基因作物的商业化种植以来，全球转基因作物的种植面积持续了21年的高速增长，截至2017年种植面积已达到1.898亿hm2[1]。玉米作为种植面积全球第二的转基因作物，85%的玉米应用于畜禽饲料[2]。同时，畜禽饲用具有大剂量性、长期多代性等特点。因此，开展转基因玉米的饲用安全性评价具有重要意义。

转基因作物安全性评价的核心是研究转基因外源成分的消解和转移规律。肠道作为机体抵御外界环境、细菌和食物抗原的第一道防线，以及机体最大的免疫器官，与机体的营养代谢、机体免疫等有着重要的关系[2-4]。因此，转基因作物对畜禽肠道健康的影响是转基因作物饲用安全性评价的重点。谭建庄[5]研究表明，抗草甘膦转基因豆粕对1～21 d肉仔鸡的各项肠黏膜免疫指标均没有影响。孙锴[6]研究表明，含有Cry1Ac和Bar基因的双抗水稻对肉鸡小肠的相对重量和长度等发育指标以及小肠绒毛高度与宽度、隐窝深度和肠壁厚度等指标均没有显著影响。Trabalza-Marinucci等[7]在光镜下观察到转基因玉米（Bt176）组母羊与羔羊的十二指肠、盲肠阑尾、瘤胃和皱胃的组织形态与非转基因对照组相比没有显著差异。本实验室前期研究了转Cry1Ac基因玉米对纯系白来航母鸡肠道组织形态的影响，结果表明，试验组与对照组小肠各段绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度等指标没有显著差异[8]。目前已报道的开展转maroACC基因玉米长期、跨代饲用安全性评价的研究很少，因此本研究以转maroACC基因玉米（CC）为试验材料，同源非转基因玉米（CT）作为对照，在实验室前期研究的基础上，由亲代蛋鸡繁育子代蛋鸡，继续饲喂与亲代蛋鸡相同的试验饲粮，研究跨代饲喂转maroACC基因玉米对子代母鸡和公鸡肠道发育和组织形态等指标的影响，为转maroACC基因玉米蛋鸡的饲用安全性评价提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

转maroACC基因玉米（CC）和同源非转基因玉米（CT）均来源于同一亲本（中国农业大学），且种植、收割、运输、加工等各个过程的条件完全相同，为了避免交叉污染，转基因玉米与同源非转基因玉米在整个过程要保证严格分开。非转基因豆粕来自九三粮油工业集团（中国，哈尔滨）。

1.2 试验动物与饲养管理

试验选用48只健康纯系白来航产蛋母鸡（50周龄）随机分为2种饲粮处理（8个重复/处理，3只鸡/重复），即：同源非转基因玉米饲粮（CT）和转maroACC基因玉米饲粮（CC）。试验采用三层立体笼养，采用自然光照+人工补光保持16 h光照，光照强度为20 lx，温度(22±3)℃，湿度50%～55%，自由采食和饮水，合理通风。每天上午8：00和下午4：00各添料1次，下午3：00捡蛋一次。按照正规程序进行免疫，每周至少带鸡消毒1次。连续饲喂12周后，通过人工授精、孵化得到子代蛋鸡。

子代蛋鸡根据亲代母鸡的分组分为2个饲粮处理组：①CT玉米喂母鸡/CT玉米喂子代鸡（CT-CT）、②CC玉米喂母鸡/CC玉米喂子代鸡（CC-CC）。子代蛋鸡0～8周混合饲养，第8周开始公母分开饲养。子代公鸡（6个重复/处理，6只鸡/重复）饲喂32周，母鸡（8个重复/处理，3只鸡/重复）饲喂36周。试验结束后，每个重复随机选择一只蛋鸡（6只公鸡/处理和8只母鸡/处理）分别屠宰取样。根据蛋鸡生产管理规程对孵化、育雏等过程中的温度、湿度、饲养密度等进行控制[9]。雏鸡舍第1～3 d 35～33 ℃，3～7 d 33～32 ℃，以后每周降低3℃，直到第6周降到22～23℃；第1～10 d湿度为70%，前6周65%～60%，以后保持在50%～55%。第1周光照为23 h，第2～17周逐渐减少到自然光照，第18周开始每周增加0.5～1 h，直到达到产蛋需要光照（16 h）。自由饮水，合理通风，按照正规程序进行消毒和免疫。

1.3 试验饲粮

根据我国蛋鸡饲养标准（NY/T 33—2004）和NRC（1994）蛋鸡营养需要以及白来航蛋鸡饲养手册配制玉米-豆粕型基础饲粮。利用PCR方法和ELISA方法对玉米原料和试验饲粮检测转基因片段，结果CC玉米原料及饲粮中检测到了maroACC基因和maroACC蛋白，CT玉米原料和饲粮中没有检测到maroACC基因和maroACC蛋白[10]。玉米原料和试验饲粮的组成及营养水平见表1和表2。

表1 玉米原料化学成分和氨基酸含量分析（DM基础）

1.4 样品采集和指标测定

1.4.1 肠道长度

在试验第32周末，每个重复随机选择1只公鸡，每个处理共6只公鸡；在试验第36周末，每个重复随机选择1只母鸡，每个处理共8只母鸡，称重、颈部放血处死后，分离肠道，并测定肠道长度，分别计算小肠（十二指肠、空肠、回肠）和大肠（盲肠、直肠）各段的体重校正长度。

各段肠道体重校正长度（cm/kg）=各段肠道长度/活体重[14]。

1.4.2 小肠组织形态

肠道长度测定结束后，用生理盐水将十二指肠、空肠、回肠内容物冲洗干净，选取每个肠段中间部位1 cm左右放于4%的多聚甲醛溶液中固定，室温保存。固定的小肠组织标本，经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋处理后，制成切片，经苏木精-伊红染色后用光学显微镜观察，测量各肠段的绒毛高度和隐窝深度并计算二者的比值。

1.5 数据统计与分析

试验数据使用Excel 2016进行初步整理，使用JMP 10.0软件进行T-test检验，结果用“平均值±标准差”表示，以P＜0.05和P＜0.01分别作为差异显著和极显著性的判别标准，0.05＜P＜0.1作趋势分析。

2 结果

2.1 子代蛋鸡肠道长度测定结果

转maroACC基因玉米和同源非转基因玉米对子代蛋鸡肠道长度影响的结果如表3所示。与CT-CT组相比，CC-CC组对子代公鸡小肠总长、大肠总长以及肠道总长的绝对长度和体重校正长度均没有显著影响。与CT-CT组相比，子代母鸡小肠总长、大肠总长以及肠道总长的绝对长度和体重校正长度也没有显著差异。

2.2 子代蛋鸡肠道组织形态测定结果

与CT-CT组相比，CC-CC组对子代母鸡小肠各段的绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度等指标均没有显著影响（表4）；CC-CC组对子代公鸡小肠各段绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度均没有显著影响（表5）。

由图1可知，CT-CT组和CC-CC组子代公鸡和母鸡小肠各段黏膜层次分明，结构完整。小肠隐窝排列紧密整齐，无可见的病理学变化。

3 讨论

3.1 玉米原料和饲粮营养成分含量分析

实质等同性原则是转基因作物饲用安全性评价的重要原则[15]，转基因玉米营养成分含量分析是转基因玉米饲用安全性评价的第一步，也是决定转基因玉米是否可以开展饲用安全性评价的决定因素。本试验中用于配制亲代蛋鸡和子代蛋鸡（母鸡和公鸡）饲粮的转maroACC基因玉米与同源非转基因玉米常规概略养分以及氨基酸含量具有相似性，与文献报道的结果相符合[13，16]，而且养分含量的范围也在正常范围之内[11-13]。钟儒清等[17]利用仿生消化方法体外测定了本试验中的转maroACC基因玉米（CC）和同源非转基因玉米（CT）原料以及饲粮的体外干物质消化率、体外能量消化率和体外消化能，结果CC组与CT组相比，玉米原料和饲粮体外全消化道的干物质消化率、能量消化率和消化能均没有显著差异。该结果为本试验中转maroACC基因玉米和同源非转基因玉米作为开展饲用安全性评价材料的可行性提供了依据。

表2 饲粮组成及营养水平

表2 （续） 饲粮组成及营养水平

表3 转基因玉米对子代蛋鸡肠道长度的影响

表4 转基因玉米对子代母鸡肠道组织形态的影响

表5 转基因玉米对子代公鸡肠道组织形态的影响

3.2 转基因玉米对子代蛋鸡肠道长度和组织形态的影响

肠道是动物消化吸收营养物质的主要场所，肠道健康对于维持动物正常的生长发育、提高生产性能具有重要意义，畜禽肠道发挥消化吸收、黏膜免疫等功能依赖于肠道结构和功能的完整性。肠道绒毛高度和绒毛面积增加，小肠与营养物质的接触面积会增加，从而对营养物质的吸收能力增强。隐窝深度增加，表明组织周转代谢增加，对营养物质的需求增加，动物利用养分的效率会下降，从而导致生产性能下降。绒毛高度/隐窝深度可以综合反映小肠的功能状态，比值增大表明肠道发育改善，比值下降则表明肠道消化吸收能力下降。杯状细胞的功能有：①分泌黏液；②摄取葡萄糖和氨基酸；③护送食物到树突细胞（一种免疫细胞），与治疗炎性肠道疾病、食物过敏等相关。杯状细胞数量的增加对于增强肠道黏膜免疫系统的抵抗作用具有重要作用[18]。

图1 子代蛋鸡肠道组织形态结构（HE染色，40×）

高春起[19]研究表明，转植酸酶基因玉米对海兰褐蛋鸡十二指肠、空肠和回肠的相对重量、相对长度、绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度均没有显著影响。周晖[20]研究表明，转植酸酶基因玉米对肉仔鸡小肠各段的长度指数、重量指数和小肠总重量指数均无显著影响，十二指肠的绒毛高度和隐窝深度也没有显著影响，而且肠道组织形态也没有可见的病理变化。徐以娟[21]研究表明，饲喂含转基因植酸酶玉米组和非转基因玉米组的杜长大三元杂交断奶仔猪小肠各段（十二指肠、空肠和回肠）的长度指数、重量指数以及小肠总重量指数均未出现显著差异，十二指肠的绒毛高度、隐窝深度和黏膜厚度等指标两组之间也没有显著差异，表明饲喂转基因玉米对断奶仔猪的小肠发育未产生明显的不良影响。Walsh等[22]研究显示，转Bt基因玉米除了降低断奶仔猪十二指肠每微米绒毛杯状细胞数量外，对肠道绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度等指标均没有影响。本试验中CC-CC组对子代母鸡和公鸡小肠、大肠及肠道总长的绝对长度和体重校正长度、小肠各段绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度等指标均没有显著影响，研究结果与前人研究结论一致。

4 结论

本试验结果表明，与同源非转基因玉米处理组相比，跨代饲喂转maroACC基因玉米对子代母鸡和公鸡肠道绝对长度和体重校正长度、小肠各段组织形态等指标均没有显著影响；子代母鸡和公鸡小肠各段组织形态未发现可见的病理变化。