miR-17-5p靶向MICB减弱NK细胞对肝癌细胞的毒性作用①

贾 萌 薛焕洲 申 权 余 淼 贾江坤 王佳佳 徐 建

(河南省人民医院肝胆外科,郑州 450000)

肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是消化道最常见的恶性肿瘤之一，位列致死性肿瘤的第四位，严重危害人们的身体健康。自然杀伤细胞(Natural killer cell，NK)在机体肝脏中含量丰富，约占肝脏总淋巴细胞的30%～50%，其作为机体重要的天然免疫细胞，在抗肿瘤中起关键作用[1]。主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类链相关基因B(Major histocompatibility complex class Ⅰ chain-related gene B，MICB)是NK细胞表面主要活化性受体(Natural killer group 2 member D，NKG2D)的重要配体，主要表达于肿瘤(包括骨髓瘤、胃癌、肝癌、肺癌等)细胞和一些病毒感染的细胞表面。肿瘤细胞表面MICB与NK细胞表面NKG2D结合后，可激活NK细胞的杀伤功能，从而发挥免疫监视作用[2]。已有研究显示，MICB表达的下调能够加速肿瘤免疫逃逸[3]。组蛋白脱乙酰酶(Histone deacetylase，HDAC)抑制剂(丙戊酸钠)能够诱导MICB表达，从而引起NKG2D介导的NK细胞活化，使NK细胞对肝癌细胞的毒性作用增强[4]。因此，了解肿瘤细胞中MICB的调节机制有助于开发基于NK细胞的有效抗肿瘤疗法，对肝癌的治疗具有重要临床意义。miRNA作为基因表达调控的关键参与者，在NK细胞介导的抗肿瘤免疫逃逸调节中的作用日益受到关注。已发现一些miRNAs能够靶向MICB mRNA，参与调控NK细胞介导的细胞毒性[5，6]。miR-17-92簇位于人13q31位点，能够编码包括miR-17-5p在内的多个miRNA，与包括肝癌在内等多种人类癌症发展机制有关，且其表达与功能因不同细胞类型而存在差异[7]。生物信息学分析预测miR-17-5p是MICB的一种miRNA调节因子。然而，miR-17-5p在肝细胞癌中对NK细胞毒性的敏感性尚不清楚。本研究旨在探讨肝细胞癌HepG2细胞中miR-17-5p在NK细胞介导的细胞毒性敏感性中的调控作用。

1 资料与方法

1.1临床资料 回顾性分析本院2015年1月至2016年6月行手术切除的肝细胞癌患者60例的肿瘤标本及癌旁非肿瘤组织标本，其中男36例，女24例，年龄30～70岁，平均(49±13)岁，术前均未进行抗肿瘤等其他治疗，且均经术后病理学检查确诊为HCC，所有患者血清表面抗原(HbsAg)均呈阳性。根据《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》(2001年)[8]，Ⅰ/Ⅱ期24例、Ⅲ/Ⅳ期36例。高分化癌18例、中分化癌17例、低分化癌25例。伴转移(包括肝门淋巴结转移、肝外转移)25例，不伴转移35例。另选择同期于本院接受肝脏手术的肝血管瘤患者(正常肝组织标本)20例，男12例，女8例，年龄30～70岁，平均(48±11)岁。两组受试者年龄、性别等资料均衡，差异无统计学意义(P>0.05)。肝癌、癌旁组织和正常肝组织的获取均经受试者知情同意，并签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1细胞培养 对NK细胞毒性敏感的人肝细胞癌HepG2细胞购自中国科学院细胞库，冻存在本实验室，以进行后续的复苏，待后续实验使用。将细胞维持在含有10%胎牛血清(FBS，Life Technologies)，100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素的DMEM培养基(Sigma-Aldrich公司)中，置于37℃ 5%CO2的潮湿培养箱中培养。

依赖于NKG2D受体的自然杀伤细胞NK-92MI细胞系购自中国科学院细胞库，置于含200 U/ml重组人白细胞介素-2(IL-2)、0.1 mmol/L巯基乙醇、12.5%马血清和10%FBS的α-MEM培养基中培养。

1.2.2瞬时转染和处理 构建含野生型MICB基因3′UTR序列和突变型MICB基因3′UTR序列的pCHECK2-MICB-3′UTR-Wt和pCHECK2-MICB-3′UTR-Mut的荧光素酶报告基因表达载体。miR-17-5p相关表达质粒包括：miR-17-5p-mimic及其阴性对照miR-17-5p-NC、anti-miR-17-5p及其阴性对照anti-miR-17-5p-NC均购自Genecopoeia公司。

实验一：根据Lipofectamine 2000(Invitrogen)制造商说明书，将miR-17-5p mimic、anti-miR-17-5p 及其相应阴性对照质粒分别转染至HepG2细胞中。转染48 h后，收集细胞进行Western blot或qRT-PCR分析确定转染效率。

实验二：根据Lipofectamine 2000制造商说明书，将miR-17-5p mimic、anti-miR-17-5p及其相应阴性对照质粒及MICB-3′UTR-Wt、MICB-3′UTR-Mut质粒共转染至HepG2细胞中。

实验三：根据制造商说明书将miR-17-5p mimic、miR-17-5p-NC转染至HepG2细胞中培养24 h后，在培养体系中加入1 mmol/L丙戊酸钠(Sigma-Aldrich)孵育24 h，再进行后续实验。

1.2.3荧光素酶报告基因测定 分别用miR-17-5p mimic、anti-miR-17-5p及其相应阴性对照质粒与转染MICB-wt或MICB-mut荧光素酶报告基因表达载体的HepG2细胞进行共转染。转染48 h后收集细胞，使用双荧光素酶报告基因测定系统(Promega)进行分析。使用GloMax荧光读数器(Promega)检测荧光素酶活性。共转染海肾萤光素酶组成型表达的pCHECK-2载体作为内部对照。

1.2.4NK细胞介导的细胞毒性测定 采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega)评估NK-92MI介导的细胞毒性。以质粒转染或未转染的HepG2细胞作为靶细胞，将NK-92MI细胞作为效应细胞，分别按效靶比8∶1、4∶1、2∶1将效应细胞和靶细胞加入96孔板中，靶细胞每孔10×104个细胞，将NK-92MI细胞接种至HepG2细胞中，于37℃下共孵育4 h后，收集上清液，于490 nm处检测乳酸脱氢酶(LDH)活性。LDH是细胞裂解时释放的稳定胞质溶酶。

1.2.5实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 使用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞和组织中提取总RNA。使用Reverse Transcription Kit(TaKaRa)将RNA逆转录为cDNA。使用SYBR Green(TaKaRa)进行实时PCR分析。以β-Actin或U6作为内参。利用ABI7500系统(Applied Biosystems)进行qRT-PCR反应。分别以β-actin和U6作为内参，用2-ΔΔCt法计算miR-17-5p和MICB相对表达水平。qRT-PCR反应条件:95℃ 45 s，56℃ 30 s，72℃ 3 min，共40个循环。引物设计如下：MICB：forward 5′-ACCTGGCTATGAACGTC-ACA-3′，reverse 5′-CCCTCTGA-GACCTCGCTGCA-3′；miR-17-5p：5′-ACTACCTGCACTGTAAGCACTTTG-3′；β-actin：forward 5′-CCACGAAACTACCTTCAACTC-3′，reverse 5′-TCATACTCCTGCTGCTTGCTGATCC-3′；U6：5′-CAAATTCGTGA-AGCGTTCCATAT-3′。

1.2.6蛋白免疫印迹(WB) 使用补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和苯甲基磺酰氟尿苷(Roche)的哺乳动物蛋白质提取试剂RIPA(Beyotime)裂解细胞。通过10%SDS-PAGE分离50 μg 蛋白质提取物，转移至0.22 mm硝酸纤维素膜(Sigma)中，并与特异性抗体一起孵育。使用Quantity One软件(Life Technologies)评估相对蛋白表达水平。MICB和β-actin抗体购自Abcam。

2 结果

2.1转染质粒后各组细胞中miR-17-5p和MICB的表达情况 如图1A所示，与miR-17-5p-NC组相比，miR-17-5p-mimic组miR-17-5p表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与anti-miR-17-5p-NC组相比，anti-miR-17-5p组miR-17-5p表达水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

如图1B、C所示，与miR-17-5p-NC组相比，miR-17-5pmimic组HepG2细胞中，MICB mRNA和蛋白表达水平均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与anti-miR-17-5p-NC组相比，anti-miR-17-5p组HepG2细胞中，MICB mRNA和蛋白表达水平均显著增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2miR-17-5p通过MICB 3′UTR内的结合位点下调MICB基因表达 根据TargetScan预测(图2A)，在MICB mRNA的3′-UTR中存在miR-17-5p的靶位点。利用荧光素酶活性测定发现(图2B)，与miR-17-5p-NC+MICB 3′UTR-Wt组相比，miR-17-5p-mimic+MICB 3′-UTR-Wt组荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。而miR-17-5p-NC+MICB 3′UTR-Mut组与miR-17-mimic+MICB 3′-UTR-Mut组的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3miR-17-5p与MICB蛋白在HCC组织中的表达及与临床病理特征的关系 与正常组织和对应癌旁非肿瘤组织相比，miR-17-5p在HCC组织中的表达水平显著增加(图3A)，而MICB蛋白表达水平显著降低(图3B)，差异均有统计学意义(P<0.05)。

如表1所示，miR-17-5p和MICB蛋白的表达在不同年龄、性别患者中差异无统计学意义(P>0.05)。肿瘤直径≥5 cm时，miR-17-5p表达水平显著高于肿瘤直径<5 cm，差异有统计学意义(P<0.05)。与淋巴结无转移患者相比，当出现淋巴结转移时HCC肿瘤组织中miR-17-5p的表达显著增加，而MICB 蛋白表达水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。TNM Ⅲ/Ⅳ期患者miR-17-5p表达水平显著高于TNM Ⅰ/Ⅱ期患者，而MICB蛋白表达水平显著低于TNM Ⅰ/Ⅲ期患者，差异均有统计学意义(P<0.05)。随肿瘤分化程度的降低，miR-17-5p表达水平逐渐增加，而MICB蛋白表达水平逐渐降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

图1 转染质粒后各组细胞中miR-17-5p和MICB的表达情况Fig.1 Expression of miR-17-5p and MICB in each group after plasmid transfectionNote: Compared with blank group，*.P<0.05；compared with miR-17-5p-NC group，#.P<0.05；compared with anti-miR-17-5p-NC group，△.P<0.05.

图2 miR-17-5p通过MICB 3′UTR内的结合位点下调MICB基因表达Fig.2 miR-17-5p down-regulates MICB gene expression through binding site within MICB 3′UTRNote: *.P<0.05.

图3 miR-17-5p与MICB在HCC组织中的表达情况Fig.3 MICB expression in HCC tissuesNote: *.P<0.05.

CharacteristicnmiR-17-5pt/FPMICB proteint/FPAge<50 year231.88±0.120.9920.3250.70±0.041.8830.065≥50 year371.91±0.110.68±0.04GenderMale241.90±0.110.0001.0000.69±0.040.0001.000Female361.90±0.100.69±0.03Tumor diameter<5 cm190.95±0.0738.3710.0001.06±0.0838.1090.000≥5 cm412.34±0.150.52±0.03Distant metastasisYes351.62±0.1021.6450.0000.83±0.0721.8400.000No252.29±0.140.49±0.04Degree of differentiationHigh181.15±0.08414.3660.0001.08±0.09637.4150.000Middle171.93±0.150.62±0.03Low252.42±0.170.45±0.04TNM stagingⅠ/Ⅱ241.17±0.0532.3000.0001.00±0.0644.4500.000Ⅲ/Ⅳ362.39±0.180.48±0.03

图4 HCC组织中miR-17-5p和MICB 蛋白表达水平的相关性分析Fig.4 Correlation analysis of miR-17-5p and MICB protein expression in HCC tissues

图5 miR-17-5p通过靶向MICB减弱NK细胞介导的细胞毒性Fig.5 miR-17-5p attenuates NK cell-mediated cytotoxicity by targeting MICBNote: *.P<0.05.

2.4miR-17-5p与MICB 蛋白在HCC组织中表达的相关性 在HCC肿瘤组织中随miR-17-5p表达水平的增加，MICB蛋白表达水平逐渐降低。相关性分析结果显示，二者呈明显负相关(P<0.05)。见图4。

图6 miR-17的上调抑制丙戊酸钠对NK细胞毒性的增强Fig.6 Upregulation of miR-17 inhibits the enhanced cytotoxicity of sodium valproate on NK cellsNote: *.P<0.05.

2.5miR-17-5p通过靶向MICB减弱NK细胞介导的细胞毒性 不同效靶比时，在HepG2细胞中，与miR-17-5p-NC组相比，miR-17-5p-mimic组NK细胞毒性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-17-5p-mimic+MICB 3′UTR-Mut组相比，miR-17-5p-mimic+MICB-3′UTR-Wt共转染组中NK细胞毒性显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5A。

WB结果显示，与miR-17-5p-NC组相比，miR-17-5p-mimic组HepG2细胞中MICB蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与miR-17-5p-mimic+MICB 3′UTR-Mut组相比，miR-17-5p-mimic+MICB-3′UTR-Wt组中MICB蛋白表达水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5B。

另外，与anti-miR-17-5p-NC组相比，anti-miR-17-5p组NK细胞毒性显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5C。WB结果显示，与anti-miR-17-5p-NC组相比，anti-miR-17-5p组MICB蛋白表达水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5D。

2.6miR-17-5p的上调抑制丙戊酸钠对NK细胞毒性的增强 与Ctrl组相比，丙戊酸钠组细胞中MICB表达水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与丙戊酸钠+miR-17-5p-NC组相比，丙戊酸钠+miR-17-5p-mimic组细胞中MICB表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6A。进一步研究HDAC抑制剂对NK细胞毒性的增强作用是否与miR-17表达调控有关。在不同效靶比下，与Ctrl组相比，丙戊酸钠组NK细胞毒性显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与丙戊酸钠+miR-17-5p-NC组相比，丙戊酸钠+miR-17-5p-mimic组NK细胞毒性显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图6B。

3 讨论

微小RNA(miRNA)作为一种非编码RNA，在肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭和免疫逃逸等多种生物进程中具有重要作用[9]。已有研究证实，miR-17-5p在结直肠癌、胃癌、肝癌等多种癌症中的表达失调[10,11]。本研究数据发现，在HCC肿瘤组织中，miR-17表达水平显著升高，且高miR-17-5p水平与TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度有关，提示miR-17高表达促进肿瘤发生进展。然而miR-17-5p在肝癌疾病进展中的机制尚不清楚。

NK细胞作为体内重要的淋巴细胞之一，在天然免疫和获得性免疫中发挥重要作用。NK细胞的功能受其表面活化性或抑制性受体的调节。活化性或抑制性受体通过介导NK细胞的不同识别模式，传递活化或抑制信号，在抗感染、抗肿瘤及免疫调节等方面发挥重要免疫功能[12]。NKG2D是NK细胞最主要的活化性受体之一，能特异地与肿瘤细胞表面的相应配体MICB结合而使NK细胞活化，从而激活NK细胞对肿瘤细胞的毒性作用，在肿瘤免疫监视中发挥重要作用。当肿瘤细胞表面MICB发生结构改变或表达被抑制时，导致NK细胞无法活化，使其对肿瘤细胞的毒性作用被抑制，无法清除肿瘤细胞，从而引起肿瘤免疫逃逸的发生[13]。

肿瘤细胞存在多种机制来逃避NK细胞介导的肿瘤细胞杀伤作用[14]。在肝脏恶性肿瘤的微环境中，肿瘤抗原、微环境中的细胞因子以及其他免疫细胞的相互作用均可逃避NKG2D介导的识别，导致NK细胞活化能力及肿瘤细胞清除能力被抑制，从而参与肿瘤细胞免疫逃逸发生[15,16]。近来研究发现，多种miRNA参与NK细胞介导的抗肿瘤免疫逃逸调节过程。临床证据证实，miRNAs通过抑制NKG2D配体MICB的表达，参与NK细胞的肿瘤免疫逃逸[17]。miRNA作为多基因多靶点调控的上游调控因子，能够通过与目的靶基因mRNA的碱基特异性配对，引起目的靶基因mRNA降解或抑制其翻译，从而在转录后水平调控目标基因的表达。miRNAs在生物进程中的调控作用十分复杂，一个miRNA能够调控多个目标基因，且同一个目标基因可同时受多个miRNA调控。生物学预测发现，在MICB mRNA的3′-UTR中存在miR-17-5p的靶位点。本研究进一步采用荧光素酶报告基因测定证实，miR-17-5p是靶向MICB的调节分子之一，能够通过与MICB mRNA 3′UTR内的位点结合，下调MICB基因表达，miR-17-5p过表达能够显著抑制HepG2细胞中内源性MICB的表达。另外，在HCC肿瘤组织中，miR-17-5p与MICB表达呈显著负相关，进一步证实MICB是肝细胞癌中miR-17的直接靶标之一。

已报道，包括miR-20a、miR-93、miR-106b、miR-302c、miR-520c等多种miRNAs能够靶向调控MICB mRNA的3′-UTRs从而调节MICB的蛋白表达水平[18]。研究发现，miR-10b通过靶向MICB mRNA的3′-UTR，使Hela、PC-3、DU145等多种肿瘤细胞表面MICB表达被抑制，导致NKG2D识别减少，从而减少NK细胞对肿瘤细胞的毒性作用[19]。本研究发现，NK细胞毒性测定和蛋白免疫印迹结果显示，在不同效靶比时，miR-17-5p过表达均能够降低HepG2细胞中NK细胞介导的细胞毒性，同时能够抑制MICB表达，而抑制miR-17-5p表达则能够增加NK细胞介导的细胞毒性，同时促进MICB表达，提示miR-17-5p能够调控HepG2细胞对NK细胞毒性的敏感性，且这一作用与其对MICB的靶向调控有关。这些结果表明，miR-17-5p过表达通过抑制细胞表面MICB表达，从而降低HepG2细胞对依赖于NKG2D配体的NK细胞所介导的细胞毒性敏感性，进而抑制NK细胞对肝癌细胞的免疫清除，保护HCC细胞免受NK细胞攻击。

已证实，HDAC抑制剂如丁酸钠和丙戊酸钠能够通过上调NKG2D配体MICB表达，增强肿瘤细胞对NK细胞介导的细胞毒性敏感性[20]。为进一步探讨miR-17-5p在调节HepG2细胞对NK细胞毒性敏感性中的作用，本研究检查了miR-17-5p是否参与HDAC抑制剂丙戊酸钠介导的NK细胞毒性增强过程。结果发现，丙戊酸钠处理能够显著抑制HepG2细胞中miR-17-5p的表达，增加MICB的表达，从而增强NK细胞毒性。而miR-17过表达能够抑制丙戊酸钠诱导的MICB表达的增强，使HepG2细胞对NK细胞介导的细胞毒性敏感性降低。这些数据表明，miR-17-5p下调是HDAC抑制剂介导NK细胞毒性增强的可能机制之一。提示，靶向miR-17-5p可能成为改善HCC中基于NK细胞抗肿瘤疗法的新策略。

综上所述，miR-17-5p通过靶向MICB降低HepG2细胞对NK细胞介导的细胞毒性敏感性，导致NK细胞的抗肿瘤免疫活性被抑制，从而抑制NK细胞对肝癌细胞的免疫清除，保护肝癌细胞免受NK细胞攻击，参与肿瘤细胞免疫逃逸过程。