枯草芽孢杆菌 ATCC9372产生海藻酸寡糖通过T辅助细胞2型相关细胞因子能有效抑制哮喘发作的研究

沙尚清 尹 梅 韩学梅 杨春霞 舒 红

(宁夏医科大学银川医院呼吸内科，银川 750000)

哮喘又名支气管哮喘是一种普遍的严重危害人类健康的疾病，发病率逐年增高，治疗十分棘手[1]。根据世界卫生组织2015年发布的哮喘资料显示，全世界大约有2.55亿人患有哮喘。 2013年一份报告显示，仅中国就大约有2 000万哮喘患者，其中16岁以下的未成年人和60岁以上的老人发病率更高[2]。较10年前的调查结果分别增高了117.8%和160.9%[3]。哮喘诱发剂有许多，如室内和室外过敏原、病毒感染和污染。宠物皮屑和蟑螂是室内过敏原，花粉、霉菌和真菌是室外过敏原。烟草烟雾、化学刺激物和空气污染是污染物[4，5]。 哮喘的典型临床症状包括咳痰、杯状细胞增生、上皮细胞脱落、基底膜增厚、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润。 这些症状最终导致气道阻塞。哮喘发病机制较为复杂，有研究表明气道慢性炎症是哮喘的本质，其中Th1/Th2表达失衡，即Th1功能不足与Th2功能亢进是气道慢性炎症发生的基础[6]。临床研究报道，在哮喘患者中Th1/Th2失衡直接源于其上游转录因子T细胞T盒蛋白(T-box expressed in T cells，T-bet)/GATA结合蛋白(GATA-binding protein，GATA)-3平衡失调，动物实验研究结果表明，Th1特异性转录因子T-bet基因缺失可导致小鼠自发出现哮喘样气道炎症的表现[1，7，8]。 T-bet是控制Th1增殖的重要转录因子，通过IFN-γ和 IL-12相互作用可以增加Th1的表达，GATA-3是控制Th-2增殖的转录因子[9]。支气管扩张剂，如皮质类固醇、白三烯调节剂、茶碱等药物目前用于哮喘的治疗，但是疗效甚微。大剂量皮质类固醇的吸入是控制哮喘发作的常用方法[10-13]。 然而，这种治疗方法有很大的副作用，往往会降低糖皮质激素受体结合亲和力以及T细胞反应[14]。 因此，越来越多的研究致力于从天然产物和传统药物中寻找治疗哮喘的药物。海藻酸钠是海藻茎上的一种黏性物质[15]。已被用作抗慢性溃疡性结肠炎的抗炎剂以及抗氧化剂。 也被用于封装材料和微针结构。已有研究表明海藻酸寡糖(Alginate oligosaccharides，AO)可以克服耐药性，增强抗生素的作用，并能用于高盐饮食诱导的大鼠高血压模型的治疗[16]。 尽管很多研究证实了AO的抗炎和抗氧化特性，但其在治疗哮喘中的作用尚不清楚。 因此，本研究主要研究了由枯草芽孢杆菌ATCC9372产生的AO对卵清蛋白(OVA)诱导的小鼠哮喘模型的治疗作用[6]。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组 32只健康8周龄的SPF级小鼠雌雄各半，体重20 g，购自扬州大学实验动物中心。12 h昼夜交替，给予充足的水和食物饲养。按照实验要求随机分为4组，每组8只(n=8)，分别为正常对照组、OVA诱导哮喘模型组、海藻酸寡糖(AO)低剂量治疗组：50 mg/kg和海藻酸寡糖(AO)高剂量治疗组：200 mg/kg。

1.1.2药物 鸡卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)购自上海朗顿生物科技有限公司；枯草芽孢杆菌购自北京金四环科技有限责任公司。

1.1.3试剂及仪器 光学显微镜购自上海光学仪器厂；-20℃低温冰箱购自北京福意电器有限公司；低温高速离心机购自H2050R-1湖南湘仪离心机有限公司；CO2细胞培养箱和流式细胞仪购自Thermo Fisher Scientific公司；Amicon过滤器购自Sigma公司；PE标记的家兔抗小鼠干扰素(Interferon，IFN)-γ购自上海生物工程有限公司；IL-4购自南京建成生物工程研究所；小鼠β-肌动蛋白(Actin)检测引物由上海生工生物工程有限公司合成；山羊抗小鼠CD3、CD8、CD68和CD4均购自武汉谷歌生物科技有限公司； NaCl、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、CaCl2和水合氯醛购自上海试一化学试剂有限公司；蛋白胨、酵母提取物和海藻酸购自偃师市百家工贸有限公司；甘露糖醛酸寡糖DP5购自法国ELICITYL SA公司。

1.2方法

1.2.1模型制作及给药方法 ①OVA诱导哮喘模型组：第1～8天小鼠腹腔注射40 mg/L OVA抗原溶液0.5 ml、1 mg氢氧化铝水合物进行致敏反应；然后于第21～25天连续5 d用10%水合氯醛按照3 ml/kg 腹腔注射麻醉小鼠后，使用喷雾器将5%OVA溶液喷鼻30 min激发；②正常对照组：采用无菌生理盐水代替OVA溶液；③海藻酸寡糖(AO)50 mg/kg组：采用上述方法建立哮喘模型，在诱导哮喘的第25～29天，将海藻酸寡糖(AO)按照50 mg/kg剂量每天进行一次灌胃，时间间隔24 h；④海藻酸寡糖(AO)200 mg/kg组：方法同海藻酸寡糖(AO)50 mg/kg 组，第25～29天将海藻酸寡糖(AO)以200 mg/kg 剂量每天进行一次灌胃，时间间隔 24 h。4组小鼠最后一次灌胃治疗24 h后处死小鼠。

1.2.2AO生产和鉴定 从海带褐藻中提取海藻酸钠，制得AO：首先，将枯草芽孢杆菌 ATCC9372在含有0.1%海藻酸钠、1%蛋白胨、1%酵母提取物、0.2%NaCl、0.2%K2HPO4、0.1%KH2PO4和0.1%MgSO4的150 ml混合培养基中进行培养，37℃，150 r/min，培养3 d。 然后将含有芽孢杆菌的混合培养液加入到海藻酸盐培养基中(3%海藻酸钠、1%蛋白胨、1%酵母提取物、0.2%NaCl、0.2%K2HPO4、0.1%KH2PO4、0.1%MgSO4、0.05%CaCl2和0.1%微量元素调节pH7.0)，37℃温育14 d后，通过离心(10 000 r/min，30 min)获得培养上清液。 使用Amicon过滤器(Millipore，Billerica，MA，USA)分离低于分子量10 kD的AO，最后冷冻干燥，-80℃储存备用。将分子量低于10 kD的AO分离后，通过HPLC-苏州岛津LC-15C液相色谱仪分析和鉴定。

1.2.3观察项目及检测方法

1.2.3.1血清总IgE及支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性细胞和嗜酸性粒细胞数目测定 末次激发24 h后处死小鼠，立即摘眼球取血，4℃、4 000 r/min离心15 min获取血清。用1 ml(分别为0.4、0.3、0.3 ml)PBS液行支气管肺泡灌洗，回收率均>85%。BALF 4℃、1 500 r/min离心10 min，收集上清。用ELISA法检测血清中IgE;Kwik-Diff染色法计数BALF中炎性细胞和嗜酸性粒细胞的数量。

1.2.3.2免疫组织化学测量CD3+、CD4+、CD8+和CD68+的表达变化及其特征性分泌形式的表达 用3%过氧化氢的甲醇溶液处理石蜡的组织切片10 min以除去内源性过氧化物酶。使用柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L)进行抗原修复。 将载玻片与正常血清一起孵育以阻断非特异性结合，然后使用一抗(稀释1∶100～1∶200)例如兔抗小鼠CD3多克隆抗体、大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体、大鼠抗小鼠CD8单克隆抗体和大鼠抗小鼠CD68单克隆抗体；大鼠抗小鼠IL-4单克隆抗体、大鼠抗小鼠IL-5单克隆抗体、兔抗小鼠IL-6单克隆抗体、山羊抗小鼠TNF-α多克隆抗体、山羊抗小鼠IL-13多克隆抗体和兔抗小鼠IFN-γ-单克隆抗体。 再滴加二抗(1∶500)共孵育1 h。DAB显色，DAB的配制①储备液(DAB 25 mg/ml)的配制：DAB 250 mg+PBS 10 ml，待完全溶解后分装成1 ml、100 μl、50 μl、20 μl等，-20℃，冻存。②工作液：DAB 储备液20 μl+PBS 1 000 μl+3% H2O25 μl。

1.2.3.3RT-PCR 测量Th2和Th1相关细胞因子的mRNA的表达水平 小鼠肺组织总RNA提取与定量，参照试剂商所提供的产品说明书进行。PCR扩增：小鼠IL-1β引物可扩增长度为374 bp(F：5′-CTCAGAAGCAGAGCACAAGC-3′，R：5′-CTCAGTG-CAGGCTATGA C CA-3′)；IFN-γ引物可扩增长度为556 bp(F：5′-AATGAACGCTACACACTGCA-3′，R：5′-TGAAGAAGGTAGTAATCAGG-3′)；IL-13引物可扩增长度为638 bp(F：5′-GCCAGGTGTCTTAGCC-AGTC-3′，R：5′-ATGGCCTGGAACTCTGTCTG-3′)；TNF-α引物可扩增长度为286 bp(F：5′-CCACATCTCCCTCCAGAAAA-3′，R：5′-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3′)；IL-4引物可扩增长度为509 bp(F：5′-AATGAACGCTACACACTGCA-3′，R：5′-GTFATGTGGACTTGGACTCA-3′)；IL-5引物可扩增长度为483 bp(F：5′-CCAGCTAGTTGTCATCCTGC-3′，R：5′-TGAAGAAGGTAGTAATCAGG-3′)；IL-6引物可扩增长度为3 586 bp(F：5′-CCAGCTAGTTGTCA-TCCTGC-3′，R：5′-GTFATGTGGACTTGGACTCA-3′)；β-actin引物可扩增片段长度为259 bp(F：5′-GAAATCGTGCGTGACATC-3′，R：5′-GCTTGCTGATCCACATCT-3′)。

2 结果

2.1小鼠BALF中炎性细胞和嗜酸性粒细胞数目 哮喘模型的炎性细胞( 图1A )和嗜酸性粒细胞(图1B)均显著高于正常组和AO 50 mg/kg和AO 200 mg/kg组(P<0.05)。不同剂量的AO组间炎性细胞和嗜酸性粒细胞均有显著性差异；AO以剂量依赖的方式显著抑制OVA诱导哮喘模型的炎性细胞和嗜酸性粒细胞的表达。

2.2血清中IgE的表达水平 随着AO剂量的增加显著降低OVA诱导的血清中IgE的表达水平(图2)。模型组血清中的IgE的表达显著高于正常组和AO(50 mg/kg)组和AO(200 mg/kg)组。并且AO剂量越大，血清中IgE的表达越低。不同剂量的AO组间没有显著性降低。

图1 小鼠BALF中炎性细胞和嗜酸性粒细胞Fig.1 Inflammatory cells and eosinophils in mouse BALFNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;+.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05);△.AO (50 mg/kg) vs AO (200 mg/kg) (P<0.05).

图2 AO对OVA诱导哮喘模型的血清中IgE表达水平的影响Fig.2 Effect of AO on serum IgE expression in OVA-induced asthmatic modelNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;△.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05).

图3 AO对Th2和Th1相关细胞因子表达的影响Fig.3 Effect of AO on Th2 and Th1 related cytokine expressionNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;+.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05);△.AO (50 mg/kg) vs AO (200 mg/kg) (P<0.05).

图4 Th2和Th1相关细胞因子表达的mRNA的表达水平Fig.4 Expression levels of mRNAs expressed by Th2 and Th1 related cytokinesNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;+.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05);△.AO (50 mg/kg) vs AO (200mg/kg) (P<0.05).

2.3小鼠哮喘模型中Th2和Th1相关细胞因子的表达 为了检查AO对T细胞调节的影响，通过免疫组织化学测量CD3+、CD4+、CD8+和CD68+的表达变化。AO抑制CD3+、CD4+、CD8+和CD68+的表达(图3)。AO组显著低于模型组(P<0.05)，不同剂量AO组间差异显著；随着AO剂量的增加，AO对CD3+、CD4+、CD8+和CD68+的抑制程度也显著增加(P<0.05)。

2.4小鼠哮喘模型中Th2和Th1相关细胞因子的mRNA的表达水平 Th1相关因子(IL-1β和IFN-γ)和Th2相关因子(TNF-α、IL-4、IL-5、IL-6和IL-13)的mRNA的表达( 图4A )和结果统计分析(图4B)，结果可知AO降低IL-1β和IFN-γ的mRNA水平。 AO处理后Th1和Th2相关细胞因子的mRNA水平呈剂量依赖性抑制，AO显著抑制IL-5、IL-6和IL-13 mRNA水平的表达。

图5 Th2和Th1相关细胞因子其分泌形式的表达Fig.5 Expression of secreted forms of Th2 and Th1 related cytokinesNote: *.Model group vs normal group (P<0.05);#.AO (50 mg/kg) vs model group;+.AO (200 mg/kg) vs model group (P<0.05);△.AO (50 mg/kg) vs AO (200 mg/kg) (P<0.05).

2.5小鼠哮喘模型中Th2和Th1相关细胞因子其分泌形式的表达 哮喘的特征是炎性细胞分泌增加，Th2和Th1衍生的促炎细胞因子失衡。通过评估Th1相关细胞因子(IFN-γ)和Th2相关细胞因子(IL-4、IL-5、IL-6和IL-13)分泌形式的表达(图5)可知，在小鼠哮喘模型的肺组织中，Th1和Th2相关的细胞因子都过表达。 AO不仅抑制Th2相关的细胞因子，如IL-4、IL-5、IL-6和IL-13，还抑制Th1相关的细胞因子，如IFN-γ。

3 讨论

哮喘发病机制十分复杂，目前越来越多的学者认为气道的慢性炎症是哮喘的本质，Th1/Th2平衡失调是气道炎症发生的基础[6]。疾病的严重程度与浸润的炎症细胞及其细胞因子的表达有关。迄今为止，已知与CD4-T细胞和嗜酸性粒细胞有关的Th2细胞因子在哮喘的发展中起主要作用[17]。随着分子免疫学与分子生物学的飞速发展，国内外对哮喘发病机制的研究越来越深入，现在免疫疗法的概念有了较大的更新与拓展，即将有可能在基因水平上对哮喘开展免疫治疗，免疫纠偏基因治疗有望成为哮喘研究的一个新的方向[1]。

Th1相关的细胞因子(IL-12和IFN-γ)，Th2相关细胞因子(IL-4、IL-5和IL-13)，炎性细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表达失衡都与哮喘发作有关[18]。 其中IL-1是许多炎症性疾病的重要物质，IL-4和IL-13是哮喘的关键调节因子。 IL-4也可以介导免疫球蛋白(Ig)G转变为IgE并募集嗜酸性粒细胞[19]。 IL-5调节嗜酸性粒细胞的发展、活化、迁移和存活，并刺激IL-6的表达。 IL-12调节Th1和Th2表达的平衡，它也产生IFN-γ[20]。 IL-13参与B细胞活化和气道重塑，导致黏液分泌过多、杯状细胞增生、上皮细胞脱落、基底膜增厚、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润[21]。TNF-α可刺激粒细胞募集和成纤维细胞增殖。本研究中哮喘模型组小鼠肺组织中Th2和Th1的促炎症细胞尤其Th2细胞因子表现为异常增多，完全符合上述机制。我们证明AO可以减少小鼠肺泡清洗液中总炎性细胞和嗜酸性粒细胞的数量以及血清中IgE的表达水平。AO显著抑制CD4和CD68的表达。哮喘相关细胞因子 L-13，IL-4和IL-5的mRNA表达水平几乎完全被抑制。AO不仅下调Th1/2细胞增殖的转录因子(如T-bet和GATA-3)的表达水平，而且下调Th1/2细胞因子如IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13等。本研究中，AO以剂量依赖的方式降低IL-13的 mRNA表达水平，200 mg/(kg·d)的AO可以完全阻断IL-5和IL-6 的mRNA表达。 此外，AO剂量依赖性地抑制IL-5和IL-13的表达。 几项研究报道，哮喘患者肺泡清洗液中 IFN-γ水平升高，乙酰胆碱诱导的气道高反应性在IFN-γ转基因小鼠中比正常小鼠中更为严重[22]。本研究发现AO可降低OVA诱导的小鼠哮喘模型中IFN-γ水平和Th2相关细胞因子的表达。

尽管类固醇已被用作抗哮喘药物，但由于其相关的副作用已迫使研究人员寻找更有效的候选药物[23]。细胞因子可以诱导哮喘发作，积极调节这些细胞因子的化合物可能具有潜在的治疗益处。但是哮喘模型的动物实验结果能否在临床取得相同的预期甚至更好的疗效还有待于进一步的研究和探索。这项研究的结果表明，由于其抑制各种类型的细胞因子的能力，AO可能显示出作为抗哮喘药物候选物的希望。