青藤碱对阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠的保护作用及机制研究①

张家薇 薛 冰 崔正军 郭鹏飞

(郑州澍青医学高等专科学校普外科，郑州 450000)

肝脏是一种高度血管化的大器官，负责碳水化合物、蛋白质和脂类的代谢，从血液中去除药物和毒素，并调节免疫反应。因此，肝脏经常受到各种各样的威胁，尤其是各种治疗性药物的应用造成的负担和损伤，甚至会导致肝细胞死亡和肝脏功能障碍等[1]。由处方药、非处方药及草药引起的药物性肝损伤是全世界肝病的主要原因[2]。药物性肝损伤可以发展成各种形式的急性和慢性肝病[3]。大约20%的儿童急性肝衰竭病例都是由药物性肝损伤造成的[4]。因此，药物性肝损伤已成为一个亟待解决的健康问题，亦是临床医学和药物开发的一大挑战[5]。挖掘药物性肝损伤的治疗方法迫在眉睫。青藤碱是一种从中药材青风藤中提取出来的异喹啉，在中国、日本及其他亚洲国家，青藤碱被广泛应用于类风湿关节炎的治疗，具有抗炎、抗血管新生、免疫抑制等功能[6,7]。研究表明，青藤碱还有利于其他多种疾病的治疗，如癌症、神经性疼痛、脑损伤等[8-10]。据报道p38及其下游分子HSP27在急性肝损伤中具有调控细胞凋亡和炎症反应的功能[11,12]。本研究的主要目的是探索青藤碱对阿奇霉素诱导的大鼠急性肝损伤的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及主要试剂 30只6周龄SD大鼠购自中国科学院实验动物中心。阿奇霉素(Azithromycin,AZM)和青藤碱(Sinomenine,SM)(货号与规格：A7720～5 g，纯度：HPLC≥98%)来源于Solarbio。苏木素伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色试剂盒和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling,TUNEL)细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术公司。白细胞介素(Interleukin,IL)-6、IL-18和IL-1β的ELISA检测试剂盒购自默沙克公司。抗Ki67抗体、抗p38抗体、抗p-p38抗体、抗HSP27抗体和抗p-HSP27抗体购自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1动物分组及药物处理 SD大鼠随机分为3组：对照组、阿奇霉素(AZM)组和阿奇霉素+青藤碱(AZM+SM)组。AZM组腹腔注射阿奇霉素(800 mg/kg)建立急性肝损伤模型，AZM+SM组予急性肝损伤大鼠腹腔注射青藤碱(20 mg/kg)，连续7 d。对照组用生理盐水代替。

1.2.2HE染色 颈椎脱臼法处死大鼠后取出肝脏组织，去掉坏死组织及血凝块。用4%的多聚甲醛在4℃下固定24 h。PBS清洗3次，再用30%、50%和70%的酒精依次脱水10 min。去除酒精并于脱水机中脱水，然后进行石蜡包埋和切片。按照HE染色液说明书进行HE染色。光镜下观察肝脏组织病变情况。

1.2.3TUNEL染色 石蜡切片经二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化后用蛋白酶K于20～37℃处理15～30 min。PBS漂洗3次后用3%的H2O2于室温孵育20 min，随后PBS清洗3次。然后按照试剂盒说明书进行生物素标记，显色，苏木素复染后自来水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。最后显微镜下观察拍照，细胞核呈棕色颗粒的为凋亡细胞。

1.2.4免疫组化染色 石蜡切片经脱蜡再水化后用1% 的Triton-100处理15 min进行通透，再用3% 的H2O2处理15 min。5%的羊血清封闭30 min，再加入抗Ki67抗体，4℃过夜孵育，第二天加入对应的二抗(37℃,30 min)。最后进行染色封片观察。

1.2.5ELISA 肝脏组织于PBS中进行匀浆后，4℃下15 000 g离心15 min。重复离心后取上清进行检测。按照ELISA试剂盒说明书进行检测，样品加入反应孔37℃孵育45 min后用洗涤液洗涤4次，然后加入生物素标记的抗体37℃反应30 min，洗涤后加链霉亲和素-HRP混匀37℃反应30 min。最后加入显色剂避光显色15 min，再加终止液终止反应，450 nm处检测吸光值。

1.2.6蛋白印迹 首先用PBS将待测组织细胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液提取总蛋白，100℃变性5 min。然后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜，经5%的BSA封闭1 h后加入相应的一抗，4℃过夜孵育。第二天加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量。

1.3统计学分析 用SPSS16.0软件对实验数据进行统计学分析，两两比较用独立的t检验。P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1青藤碱对阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠肝脏组织病变的影响 通过HE染色观察青藤碱对阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠肝脏组织病变的影响。图1显示，对照组肝脏组织细胞排列规则有序，无病理学变化。阿奇霉素组肝脏组织细胞排列不规则、充血、细胞质空泡化、肝细胞坏死。 阿奇霉素+青藤碱组肝脏组织病变得到明显改善。上述结果表明，青藤碱可减轻阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠肝脏组织病变。

2.2青藤碱对阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠肝脏组织细胞凋亡的影响 为分析青藤碱对阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠肝脏组织细胞凋亡的影响，利用TUNEL检测细胞凋亡。如图2所示，阿奇霉组肝脏组织细胞凋亡明显高于对照组(P<0.05)。与阿奇霉素组相比，阿奇霉素+青藤碱组细胞凋亡明显降低(P<0.05)。由此可见，青藤碱可抑制阿奇霉素诱导的大鼠肝脏组织细胞凋亡。

图1 HE染色观察肝脏组织病变(×100)Fig.1 Pathological changes of liver tissues was observed by HE staining(×100)

2.3青藤碱对阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠肝脏组织细胞增殖的影响 免疫组化染色检测青藤碱对阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠肝脏组织增殖相关蛋白Ki67表达的影响。由图3可知，阿奇霉素组肝脏组织Ki67表达明显低于对照组(P<0.05)。阿奇霉素+青藤碱组Ki67表达明显高于阿奇霉素组(P<0.05)。以上结果说明，青藤碱可减弱阿奇霉素介导的对大鼠肝脏组织细胞增殖的抑制作用。

图2 TUNEL检测细胞凋亡Fig.2 Apoptosis was detected by TUNELNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs AZM group.

图3 免疫组化染色检测Ki67表达Fig.3 Expression of Ki67 was tested by immumohistoche-mical stainingNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs AZM group.

2.4青藤碱对阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠肝脏组织炎症反应的影响 通过ELISA检测促炎因子IL-6、IL-18和IL-1β水平，分析青藤碱对阿奇霉素诱导的大鼠肝脏组织炎症反应的影响。图4显示，阿奇霉素组肝脏组织IL-6、IL-18和IL-1β水平明显高于对照组(P<0.05)。与阿奇霉素组相比，阿奇霉素+青藤碱组IL-6、IL-18和IL-1β水平明显下降(P<0.05)。上述结果表明，青藤碱可减轻阿奇霉素诱导的大鼠急性肝损伤导致的肝脏组织炎症反应。

2.5青藤碱对阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠肝脏组织p38信号通路相关蛋白表达的影响 为进一步分析青藤碱影响阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠的分子机制，蛋白印迹检测p38信号通路相关蛋白表达。如图5所示，阿奇霉素组肝脏组织p-p38/p38和p-HSP27/HSP27比值明显高于对照组(P<0.05)。与阿奇霉素组相比，阿奇霉素+青藤碱组p-p38/p38和p-HSP27/HSP27比值明显降低(P<0.05)。由此可见，青藤碱可减弱阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠肝脏组织p38和HSP27磷酸化水平的升高，抑制p38信号通路的激活。

图4 ELISA检测炎症因子水平Fig.4 Levels of inflammatory factor were detected by ELISANote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs AZM group.

图5 蛋白印迹检测p38信号通路相关蛋白表达Fig.5 Expression of p38 pathway related proteins was measured by Western blotNote: *.P<0.05 vs control group；#.P<0.05 vs AZM group.

3 讨论

急性肝损伤是一种常见的临床现象，起因于各种不同的病因，如药物、毒素、缺血/再灌注和病原体等。急性肝损伤中常常会引起免疫反应和肝细胞凋亡等，最后甚至发展为急性肝衰竭。急性肝衰竭具有很高的死亡率，往往需要进行肝移植[1]。治疗急性肝损伤是人类医疗卫生健康系统的重大课题。越来越多的研究表明许多天然产物在治疗急性肝损伤方面发挥着积极作用。

大量文献报道多种植物提取物具有改善肝脏组织病变的功效。研究表明香茅草提取物可改善H2O2诱导的大鼠肝脏组织充血、浸润、细胞质空泡化和肝细胞变性等病变[13]。波棱瓜提取物可减轻四氯化碳诱导的小鼠肝脏组织浸润及肝细胞变性等组织病变[14]。Liu等[15]发现杨梅提取物中的黄酮类化合物可改善酒精诱导的小鼠肝脏组织水肿、脂肪变性等病变。本文研究结果显示，青藤碱可减轻阿奇霉素诱导的急性肝损伤，改善大鼠肝脏组织肝细胞排列不规则、充血、细胞质空泡化和肝细胞坏死等病变。

细胞凋亡在各类疾病中具有重要作用，许多植物提取物都可调控细胞凋亡。有研究发现丹参和红花提取物可降低脂多糖诱导的小鼠肝脏组织肝细胞凋亡的增加[16]。研究表明青藤碱可抑制缺血损伤小鼠脑组织细胞凋亡[17]。另外，青藤碱还可减弱慢性哮喘小鼠模型中肺部气道上皮细胞凋亡的增加[18]。Shi等[19]发现青藤碱可促进脑内出血小鼠神经元活力，抑制神经元凋亡。本文结果显示，青藤碱可抑制阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠肝脏组织细胞凋亡的增加和Ki67表达的降低。

越来越多的研究表明多种植物提取物都具有抗炎的作用。据报道南非博士茶提取物可抑制脂多糖诱导的大鼠肝脏组织IL-6、IL-1β和TNF-α水平的上升[20]。在对乙酰氨基酚诱导的肝损伤小鼠中，马齿苋提取物可降低肝脏组织IL-6和TNF-α水平的释放[21]。有研究发现青藤碱可减弱白蛋白诱导的过敏性鼻炎小鼠IL-4和IFN-γ水平的上升[22]。另外，青藤碱还可抑制佐剂性关节炎大鼠和胶原诱导性关节炎大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平的升高[23,24]。本研究结果显示，青藤碱可降低阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠IL-6、IL-18和IL-1β水平的升高，具有明显的抗炎作用。

p38信号通路在各类细胞进程中发挥重要作用，许多植物提取物都可以调节p38信号通路。据报道银杏叶提取物可通过调节p38信号通路改善四氯化碳诱导的小鼠肝脏纤维化和细胞凋亡[25]。Liu等[26]发现在脂多糖/半乳糖胺诱导的急性肝衰竭小鼠中，沙棘提取物可抑制p38磷酸化水平的升高。有研究显示青藤碱可通过降低p38磷酸化水平的升高抑制脂多糖诱导的破骨细胞生成和骨质溶解[27]。有数据表明在缺血再灌注肾损伤小鼠中，青藤碱可降低p-p38/p38比值的升高[28]。本文结果显示，青藤碱可减弱阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠肝脏组织p38和HSP27磷酸化水平的升高，抑制p38信号通路的激活

本研究表明，在阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠中，青藤碱可改善肝脏组织病变，抑制细胞凋亡的增加和Ki67表达的降低，减轻IL-6、IL-18和IL-1β水平的升高，减弱p38和HSP27磷酸化水平的上升。综上所述，在阿奇霉素诱导的急性肝损伤大鼠中，p38信号通路活化会导致炎症因子的产生和肝细胞凋亡，从而导致肝损伤的发生；青藤碱可通过干预p38信号通路的活化发挥保护作用。下一步计划研究青藤碱对缺血再灌注等其他因素引起的急性肝损伤的影响，为急性肝损伤的治疗奠定理论基础。