淫羊藿苷通过VEGF通路对缺氧诱导的脉络膜视网膜内皮细胞系RF/6A增殖、侵袭和迁移能力的调节作用①

刁婷婷 田 骋 王洪亮 姜玉珍

(南阳医专第一附属医院，南阳 473000)

随着未来人口老龄化的增加，眼病发病率及治疗费用也将不断增加[1]。过去几十年的数据显示白内障、青光眼、视网膜黄斑变性及增生性糖尿病视网膜病变等是主要的致盲性眼病[2]。研究表明脉络膜视网膜血管新生是这些眼病致盲的主要原因，神经组织的高氧需求与局部缺氧之间的失衡会引起一系列血管相关生长因子的释放，从而刺激内皮细胞的增殖和分化，进而诱导血管新生[3]。目前已存在一些治疗眼病的方法，但眼病仍然是一个巨大的健康问题，给患者和社会带来严重的负担。开发新的有效的眼病治疗方法对公共卫生健康系统具有重要意义。淫羊藿是一种重要的药用植物，在数千年的时间里被用于各种传统的中国配方以及现代中国传统的中药产品中。淫羊藿苷(化学结构式见图1)是一种典型的黄酮糖苷，被认为是天然草药淫羊霍的主要活性成分[4]。淫羊藿苷具有多种药理学活性，如骨保护、神经保护、心血管保护、抗癌及抗炎等作用[5,6]。本文主要目的是探索淫羊藿苷对缺氧诱导脉络膜视网膜内皮细胞系RF/6A增生和运动能力的调节作用及其机制。

图1 淫羊藿苷化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of Icariin

1 材料与方法

1.1细胞系及主要试剂 恒河猴视网膜血管内皮细胞RF/6A来源于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。淫羊藿苷购自Sigma公司。MTT购自上海生工。Transwell小室及人工基底膜购自美国BD公司。抗血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF),抗p-PI3K、抗 p-AKT和抗Rac抗体购自英国Abcam公司。

1.2方法

1.2.1药物处理 恒河猴视网膜血管内皮细胞RF/6A分四组：正常组(Normal)：常氧处理RF/6A；对照加药组(Icariin)：常氧+淫羊藿苷(100 μmol/L)处理RF/6A；缺氧组(Hypoxia)：缺氧处理RF/6A细胞；缺氧加药组(Hypoxia+Icariin)：缺氧和Icariin一起处理RF/6A细胞。

1.2.2MTT检测细胞增殖 各组细胞接种于96孔板中，淫羊藿苷处理24、48、72和96 h后分别加入MTT溶液孵育4 h，弃上清，然后加入DMSO振荡10 min以溶解结晶物。最后570 nm处检测吸光度值。

1.2.3Transwell检测细胞侵袭 首先用无血清培养基将待测细胞制成1×106个/ml的细胞悬液。然后将细胞悬液加入铺有人工基底膜的Transwell上室中，在下室中加入含20%胎牛血清的培养基，37℃培养24 h。接着用0.5%的结晶紫对上室底部细胞进行染色，并用棉签除去上室内侧的细胞。显微镜下观察细胞并统计细胞数量。

1.2.4划痕实验检测细胞迁移 将细胞密度为1×106个/ml的细胞悬液接种到6孔板中培养至形成单层细胞。在单层细胞上用10 μl的枪头划线，用PBS洗去因划线而脱落的细胞。显微镜下观察拍照，继续培养24 h后再取出观察拍照。

1.2.5蛋白印迹 用PBS漂洗细胞后加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解提取总蛋白，100℃变性5 min。等量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分离并转至PVDF膜。经5%的BSA封闭1 h后加入对应的一抗，4℃过夜孵育。第二天加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1.5 h。最后加入发光液后于凝胶成像仪进行曝光拍照并统计灰度值计算相对表达量

1.3统计学方法 用SPSS16.0软件对实验数据进行统计学分析，两两比较用独立的t检验。P<0.05认为存在明显差异，P<0.01认为存在显著统计学意义，P<0.001认为存在极显著统计学意义。

2 结果

2.1淫羊藿苷对缺氧诱导的RF/6A细胞形态和增殖的影响 显微镜下观察发现，缺氧处理RF/6A后细胞数目增多，正常组和对照加药组细胞数目无明显变化，缺氧加药组细胞数目少于缺氧组(图2)。由图3可知，缺氧组细胞增殖倍数明显高于对照组(P<0.05)。与缺氧组相比，缺氧加药组细胞增殖倍数明显下降(P<0.05)。上述结果表明，淫羊藿苷可抑制缺氧诱导的RF/6A细胞增殖能力的提高。

2.2淫羊藿苷可降低缺氧诱导的RF/6A细胞侵袭能力的增强 利用Transwell检测细胞侵袭，探究淫羊藿苷对缺氧处理的RF/6A细胞侵袭能力的影响。图4显示，正常组和对照加药组平均每个视野下穿过基底膜的侵袭细胞数目无明显差异。缺氧组侵袭细胞数目明显多于正常组(P<0.05)。与缺氧组相比，缺氧加药组侵袭细胞数目明显变少(P<0.05)。由此可见，淫羊藿苷会逆转缺氧造成的RF/6A细胞侵袭能力的升高。

2.3淫羊藿苷会减弱缺氧诱导的RF/6A细胞迁移能力的提高 为分析淫羊藿苷对缺氧处理的RF/6A细胞迁移能力的影响，划痕实验检测细胞迁移。如图5所示，正常组和对照加药组划痕愈合率无明显变化。与正常组相比，缺氧组划痕愈合率明显上升(P<0.05)。但缺氧加药组划痕愈合率却明显低于缺氧组(P<0.05)。上述结果说明，淫羊藿苷抑制缺氧对RF/6A细胞迁移能力的增强作用。

图2 RF/6A细胞形态Fig.2 Morphology of RF/6A cells

图3 MTT检测细胞增殖Fig.3 Cell proliferation was detected by MTTNote: *.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs hypoxia.

图4 Transwell检测细胞侵袭Fig.4 Cell invasion was detected by TranswellNote: *.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs hypoxia.

图5 划痕实验检测细胞迁移Fig.5 Cell migration was measured by wound healingNote: *.P<0.05 vs normal group；#.P<0.05 vs hypoxia.

图6 蛋白印迹检测VEGF通路相关蛋白表达Fig.6 Expression of VEGF related proteins were tested by Western blotNote: **.P<0.01,***.P<0.001 vs normal group,#.P<0.05 vs hypoxia.

2.4淫羊藿苷可抑制缺氧诱导的RF/6A细胞中VEGF通路的激活 为探索淫羊藿苷影响缺氧诱导的RF/6A细胞的分子机制，蛋白印迹检测VEGF通路相关蛋白VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac的表达。图6显示，缺氧组VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac相对表达量显著高于正常组(P<0.01)。与缺氧组相比，缺氧加药组VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac表达明显降低(P<0.01)。由此可见，淫羊藿苷可抑制缺氧引起的VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac蛋白水平的升高，从而抑制VEGF通路的激活。

3 讨论

内皮细胞在血管新生过程中起着重要作用[7]。目前抗VEGF是眼部血管新生的标准治疗策略，该治疗策略已被广泛应用于各种视网膜血管疾病，包括糖尿病视网膜病变和视网膜静脉阻塞[8]。但这些抗VEGF药物存在着一些眼部或全身性的副作用。天然产物因具有高化学多样性和生物化学特性而受到了越来越多的关注。许多天然产物被认为具有成为抗血管新生的潜力，有利于血管新生相关疾病的治疗[9]。

细胞增殖调控在各类疾病中起着重要作用[10]。目前发现了多种可以调节细胞增殖的植物提取物。有研究表明金银花水提取物可减弱VEGF诱导的RF/6A细胞增殖[11]。Balaiya等[12]发现白藜芦醇可抑制缺氧诱导的RF/6A细胞增殖。据报道淫羊藿苷会抑制低密度脂蛋白诱导的血管平滑肌细胞增殖[13]。在卵巢癌细胞A2780中，淫羊藿苷处理会降低细胞增殖能力[14]。有数据显示淫羊藿苷具有抑制肝癌HepG2细胞增殖的功能[15]。Zhang等[16]发现淫羊藿苷可减弱胆囊癌GBC-SD 和 SGC-996细胞增殖。本研究结果显示，淫羊藿苷可抑制缺氧对诱导RF/6A细胞增殖能力的增强作用。

越来越多的研究表明许多植物提取物具有抑制细胞侵袭的功效。有研究显示野艾蒿提取物可减弱人脐静脉内皮细胞侵袭[17]。Kim等[18]发现山紫菀乙醇提取物可降低人脐静脉内皮细胞侵袭能力。据报道淫羊藿苷可抑制胃癌BGC-823细胞侵袭[19]。在恶性胶质瘤U87MG细胞中，淫羊藿苷处理会减弱侵袭能力[20]。有数据显示淫羊藿苷可降低高转移的肺癌细胞PG的侵袭能力[21]。本文结果表明，淫羊藿苷可抑制缺氧对RF/6A细胞侵袭能力的增强作用。

大量文献报道了植物提取物可抑制细胞迁移。Li等[22]发现槲皮素可抑制VEGF诱导的RF/6A细胞迁移。有数据表明槲皮黄酮会以一种浓度依赖型的方式减弱RF/6A细胞迁移能力[23]。据报道山茶花果实提取物可降低血小板衍生因子BB诱导的血管平滑肌细胞迁移[24]。有研究发现淫羊藿苷可减弱食管鳞状上皮细胞癌EC109 和TE1 ESCC细胞迁移[25]。在肺腺癌细胞A549中，淫羊藿苷可抑制细胞迁移[26]。本研究结果显示，在缺氧诱导的RF/6A细胞中，淫羊藿苷处理会导致细胞迁移能力下降。

PI3K/AKT信号通路在各类疾病中发挥着重要作用[27-31]。据报道VEGF可通过PI3K/AKT信号通路调节RF/6A细胞增殖及血管形成[32]。Yu等[33]发现毛兰素可降低高糖诱导的RF/6A细胞VEGF表达，减弱VEGF诱导的RF/6A细胞PI3K和AKT磷酸化水平的升高，抑制PI3K/AKT信号通路激活。有研究发现在人脐静脉内皮细胞中，淫羊藿苷处理可降低VEGF的分泌[34]。据报道在食管癌细胞KYSE70中，淫羊藿苷处理会降低p-AKT蛋白水平，抑制PI3K/AKT信号通路的活化[35]。本文结果表明，淫羊藿苷可减弱缺氧诱导的RF/6A细胞VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac蛋白水平的升高，抑制PI3K/AKT通路的激活。

本研究表明，在缺氧诱导的RF/6A细胞中，淫羊藿苷会减弱细胞增殖、侵袭和迁移能力，降低VEGF、p-PI3K、p-AKT和Rac蛋白水平。综上所述，淫羊藿苷可通过VEGF/PI3K/AKT通路抑制缺氧诱导的RF/6A细胞增殖、侵袭和迁移。下一步计划通过体内实验研究淫羊藿苷对视网膜血管新生相关疾病的影响。