基于立即早期蛋白IE62建立水痘-带状疱疹病毒感染性滴度检测方法①

潘德全 王 玮 付文锟 蔡琳俐 叶江辉 朱 桦 程 通 夏宁邵

(国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心，厦门大学生命科学学院，厦门 361102)

水痘-带状疱疹病毒(Varicella-zoster virus，VZV)是导致水痘(Chicken pox)和带状疱疹(Shingles)的病原体。VZV初次感染可引发水痘，水痘是一种急性、高传染性疾病，多发于婴幼儿阶段；感染后病毒会长期潜伏在患者的脊髓背根神经节或颅神经的感觉神经节中，在外伤、人体衰老以及免疫低下等状况下可能会再次激活引发带状疱疹，恢复后常伴有愈后神经痛并且会引发其他较严重的神经并发症[1-4]。接种疫苗是目前预防VZV流行的最有效手段，VZV Oka株是目前主要使用的水痘减毒活疫苗株，虽然能够有效预防水痘，但由于其为混合株，仍存在一定安全隐患[5,6]。因此，开发更为安全高效的新型水痘-带状疱疹疫苗是十分必要的。病毒感染性滴度的快速检测对于疫苗效价及相关中和抗体的高效评价是十分重要的。

目前，用于检测包括VZV在内的病毒感染性滴度的经典方法主要为空斑计数法[7]。该方法是基于病毒感染细胞后导致细胞裂解形成空斑，继而通过观察统计病变斑点的数量来分析病毒滴度。空斑计数法对于多数病毒样品具有较好的适用性，然而该方法存在检测周期长、操作繁琐等缺点，难于满足快速高效检测病毒效价的需求[8]。当前随着新型检测技术的发展，以高特异性和亲和力的标记抗体为生物探针，可实现对病毒感染细胞的特异标记，从而可快速进行病毒感染性滴度的检测。在目标检测抗原的选择上，病毒编码的立即早期蛋白具有表达时间早、利于快速检测的特点，可成为较为理想的检测靶标。目前，已有多种病毒包括杆状病毒[9]、单纯疱疹Ⅰ型病毒[10]、巨细胞病毒[11]、EB病毒[12]等以病毒编码的立即早期蛋白为靶标建立了新型感染性滴度检测方法。

VZV完整基因组至少含有70个开放读码框(ORF)，目前已知编码了3种立即早期蛋白，包括IE4(由ORF 4编码)、IE62(由ORF 62和ORF 71编码)和IE63(由ORF 63和ORF 70编码)[13]。其中，IE62是目前研究中已知的功能相对较为明确的病毒蛋白，是病毒主要的转录激活因子，是病毒复制的必需蛋白，具有重要的功能[14-17]。同时研究也显示，IE62具有表达丰度较高的特点[18]。因此，本研究探索以VZV立即早期蛋白IE62作为检测抗原，制备特异性单克隆抗体，应用酶联免疫斑点技术(ELISpot)结合生物素-亲和素放大方法[19,20]，建立新型的VZV感染性滴度检测方法。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂

1.1.1主要试剂 牛血清白蛋白(BSA)、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、次黄嘌呤﹑胸腺嘧啶、氨基喋呤、TRITC标记山羊抗小鼠IgG、DMSO以及酶标试剂、小鼠抗体分型ELISA试剂盒等购自Sigma公司；PCR buffer、dNTP、Phusion DNA聚合酶、DL2000 DNA Maker、限制性核酸内切酶BamHⅠ和SmaⅠ购自TaKaRa公司；DNA片段回收和质粒小提试剂盒购自TianGen公司；Gibson Assembly Master Mix购自NEB公司；Lipofectamine 2000 转染试剂、RPMI1640和DMEM/F12 培养基、Gibco 胎牛血清购自Thermo Fisher Scientific公司；HRP标记山羊抗小鼠IgG 购自CST 公司。

1.1.2菌种与质粒 真核表达载体pLV-Puro、大肠杆菌ER2566均由本实验室保存；大肠杆菌DH5α(CB101)感受态购自TianGen公司。

1.1.3细胞株、病毒株和实验动物 小鼠骨髓瘤细胞SP2/0、人胚胎肾细胞293T、人视网膜色素上皮细胞ARPE-19均为本实验室保存；VZV pOka病毒株、VZV-rOka(EGFP)病毒株由美国Rutgers大学Hua Zhu教授实验室提供。6～8周龄SPF级BALB/c雌鼠购自上海斯莱克实验动物中心。

1.2方法

1.2.1多肽合成与偶联 应用DNAstar Protean软件对IE62基因进行分析，选取IE62 N端具有较好亲水性的多肽序列IE62-N1-15：MDTPPMQR-STPQRAG,多肽由上海生工生物公司进行合成。获得合成后的多肽干粉，将2 mg 干粉溶于500 μl MES BUFFER，2 mg BSA 溶于200 μl MES BUFFER，以及10 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)溶于1 ml ddH2O，再将500 μl的多肽溶液与200 μl的BSA溶液混合均匀，然后加入100 μl EDC，使用垂直混匀仪室温混匀2 h，然后透析至PBS，收取样品，-20℃冻存备用。

1.2.2单克隆抗体的制备 选择4只6～8周龄的BALB/c 雌鼠，以偶联的多肽抗原乳化完全弗氏佐剂进行皮下免疫，免疫剂量为100 μg/只，之后每两周使用同样的抗原乳化不完全弗氏佐剂进行加强免疫，持续免疫3针，每次免疫前采集小鼠血清。最后使用相同的抗原进行脾脏免疫，3 d后取免疫小鼠的脾脏与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合获得杂交瘤细胞，相关的细胞融合实验按照常规方法进行[21]。

1.2.3单抗筛选纯化和抗体类型及亚类鉴定 采用间接ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选。将合成的多肽包被于聚氯乙烯板上，封闭后加入待检样品进行孵育，之后加入HRP 标记的羊抗鼠二抗，最后用1∶1 混合的显色液A、B液进行显色，终止后用酶标仪测定各孔单波长450 nm的OD值，将检测阳性的克隆采用有限稀释法进行至少2次以上的克隆化，直到筛选获得稳定的克隆株。将获得的稳定克隆株细胞进行扩增培养后收集注入小鼠腹腔，待小鼠腹部明显膨大，收集腹水，用饱和硫酸铵沉淀和Protein A亲和层析纯化单克隆抗体，并采用Sigma公司的小鼠单克隆抗体分型试剂盒，按照试剂盒使用说明书鉴定单克隆抗体的类型及亚类。

1.2.4VZV IE62真核表达质粒的构建与鉴定 通过Oligo 5.0 软件设计IE62全长基因扩增引物，上游引物IE62-PLV-F：5′-TCTAGAGAATTCGGATCCATGGATACGCCGCCGATG-3′，下游引物IE62-PLV-R：5′-CCATGGCTCGAGCCCGGGTCACCCCCGACTC-TGCGG-3′，该引物由上海生工生物公司合成；以VZV pOka 基因组为模板对IE62基因全长进行PCR扩增和片段回收，再通过Gibson Assembly 系统将获得的片段与经由BamHⅠ/SmaⅠ双酶切后的pLV-Puro载体进行连接，构建VZV-IE62的真核表达质粒，转化大肠杆菌DH5α感受态，通过PCR鉴定筛选阳性克隆后交由上海生工生物公司进行测序。

1.2.5单克隆抗体的特异性鉴定 根据常规分子生物学实验方法：(1)间接免疫荧光实验：将直径为13 mm圆形玻璃片放入24孔板中，铺入1×105个/孔的ARPE-19细胞，实验组按MOI=0.1接种VZV-pOka；37℃感染48 h后，用4%多聚甲醛固定30 min并依次加入通透液、抗VZV-IE62的单克隆抗体、GAM-TRITC IgG和DAPI染液，封片后在荧光显微镜下进行结果观察。(2)免疫印迹实验：将转染pLV-IE62或pLV-puro真核表达质粒的293T细胞以及VZV-pOka感染或未感染的ARPE-19细胞经裂解液裂解后进行SDS-PAGE，随后电转移至硝酸纤维素膜上，1∶500稀释抗VZV-IE62单克隆抗体作为一抗，过氧辣根酶标记的GAM-IgG作为二抗，显色后进行结果观察。

1.2.6抗体生物素标记 根据Sigma 公司酶标试剂使用说明书，将抗VZV-IE62单克隆抗体用0.1 mol/L碳酸氢钠缓冲液(pH8.0)稀释到1 mg/ml，加入120 μl浓度为1 mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺生物素溶液(DMSO溶解)，室温混匀2 h；加入9.6 μl浓度为1 mol/L的NH4Cl，在室温下搅拌10 min，经过PBS透析除去游离的生物素；通过分子筛洗脱获得标记生物素的抗体，最后，样品加入叠氮钠(终浓度0.5 g/L)及1 g/L BSA。最终产物加入50%重蒸甘油，置于-20℃保存。

1.2.7空斑计数法测定VZV的感染性滴度[7]待感染VZV后的ARPE-19细胞90%病变后，用细胞刮收集病变细胞，加入适量病毒保护液储存于-80℃，后续实验中取出病毒常温溶解后200 g离心15 min，取上清作为VZV无细胞(cell-free)病毒悬液使用。实验之前4 h先将ARPE-19细胞以1×105个/孔的密度均匀铺于24孔细胞培养板中，加入梯度稀释后的VZV无细胞病毒，37℃孵育1 h；换液，在37℃和5%CO2的培养箱中培养 5～7 d后，利用中性红进行活细胞染色，于显微镜下观察，统计空斑数量，计算获得病毒样品的感染性滴度(PFU/ml)=(每孔平均空斑个数× 病毒稀释倍数)/每孔病毒接种量(ml)。

1.2.8基于IE62建立VZV感染性滴度检测方法 实验之前4 h先将ARPE-19细胞以1×105个/孔的密度均匀铺于24孔细胞培养板中，加入4倍梯度稀释后的VZV无细胞病毒样品100 μl，37℃孵育1 h，换液；在37℃和5%CO2的培养箱中培养32 h后，进行ELISpot实验：每孔加入100 μl 1%甲醛+0.1%戊二醛固定液，室温避光固定10 min；然后，每孔用0.3%Triton X-100室温通透细胞10 min；加入生物素标记的抗VZV-IE62单克隆抗体稀释液，37℃孵育90 min；PBST漂洗5次后加入亲和素与标记HRP的生物素混合液，37℃孵育45 min；漂洗5次，加入TMB显色液(Sigma)，室温显色10 min；扣干显色液，统计各孔的蓝色斑点数量，计算线性相关区内域斑点数量与病毒稀释度的标准曲线y=ax+b，计算获得病毒样品的感染性滴度(U/ml)=[(aN50+b)× 病毒稀释倍数]/每孔病毒接种量(ml)，其中N50 为线性区域的中位值。

1.3统计学处理 计数资料以SEM表示,采用GraphPad Prism5.01 软件中单因素方差分析统计各组间的差异,P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1抗VZV-IE62单克隆抗体的制备纯化与鉴定 本研究将人工合成多肽IE62-N1-15与BSA进行偶联后作为抗原免疫BALB/c小鼠，随后通过杂交瘤技术和间接ELISA法，经过3次有限稀释法克隆化筛选获得13株可分泌针对VZV-IE62蛋白N端的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并制备纯化获得相应的单克隆抗体。经ELISA检测评价，结果如图1所示，其中单抗1B7具有较优的免疫反应性和特异性。使用Sigma公司的小鼠单克隆抗体分型ELISA试剂盒鉴定单抗1B7属于IgG2a亚型。应用单抗1B7对分别转染pLV-Puro空载与VZV-IE62真核表达质粒pLV-IE62的293T细胞裂解液，以及与未感染或感染VZV的ARPE-19细胞裂解液进行Western blot检测。结果如图2A所示，1B7可与转染pLV-IE62质粒的293T细胞裂解液以及VZV感染的ARPE-19细胞裂解液特异性反应，检出的主要蛋白条带位置约170 kD，与VZV-IE62的分子量相当，同时与作为阴性对照的293T细胞裂解液、转染pLV-Puro空载的293T细胞裂解液和ARPE-19细胞裂解液均不反应。本研究进一步应用免疫荧光法进行1B7的反应性分析，应用1B7分别对转染VZV-IE62表达质粒pLV-IE62或对照载体pLV-Puro的293T细胞，以及感染VZV后的和未感染的ARPE-19细胞进行免疫荧光检测，检测结果如图2B、C所示，1B7能够特异性与转染了IE62表达载体或VZV感染后的细胞反应，具有良好的反应特异性。上述研究结果说明，单抗1B7可用于特异检测VZV感染后的细胞，因此本研究选择单抗1B7用于后续研究。

图1 使用ELISA方法对VZV-IE62单克隆抗体的评价Fig.1 Evaluation of anti-VZV-IE62 mAbs by ELISA

图2 抗VZV-IE62单抗1B7性质鉴定Fig.2 Identification of anti-VZV-IE62 mAb 1B7Note: A.Western blot of cell extracts of 293T cells transfected or not with pLV-Puro or pLV-IE62 and ARPE-19 cells uninfected or infected with VZV using mAb 1B7.1.Untreated 293T cells;2.293T cells transfected with pLV-Puro;3.293T cells transfected with pLV-IE62;4.Uninfected ARPE-19 cells;5.VZV-infected ARPE-19 cells；B.Immunofluorescence analysis of 293T cells transfected with pLV-Puro or pLV-IE62 using mAb 1B7;C.Immunofluorescence analysis of ARPE-19 cells mock-infected or infected with VZV using mAb 1B7.

2.2基于VZV-IE62单克隆抗体和酶联免疫斑点技术建立VZV感染细胞检测方法 本研究基于获得的VZV-IE62单克隆抗体1B7，尝试应用生物素-亲和素标记放大方法与酶联免疫斑点技术，建立VZV感染细胞的快速特异检测方法。

首先，本研究分析了生物素标记的单抗1B7用于酶联免疫斑点法特异检测VZV感染细胞的可行性。结果如图3A所示，在处理ARPE-19细胞48 h后，感染VZV活病毒的样品孔中呈现出大量的蓝色斑点，而感染灭活病毒和未感染病毒的样品孔中只有极少量的非特异性斑点，本底较低，这表明生物素标记后的1B7单抗能够特异性识别被VZV感染的细胞，能够用于VZV感染细胞的酶联免疫斑点法检测，每个显色斑点计为一个感染单元(U)。

随后，本研究继续分析了不同的感染时间对检测效果的影响。在预铺有ARPE-19细胞的6孔细胞培养板中各加入400 PFU的VZV活病毒，在感染后不同时间点分别用生物素标记的单抗1B7进行酶联免疫斑点检测，同时平行使用相同剂量的灭活病毒样品以及未感染细胞裂解液作为阴性对照。结果如图3B所示，活病毒组检测获得的斑点数量在感染后20 h至32 h呈现上升趋势，感染32 h后斑点数量趋于稳定，而斑点个体面积会持续增加；灭活病毒组在样品加入细胞后的28 h前可检出斑点，但斑点数随加入时间增加而减少，至28 h后为阴性。该现象的原因可能为所使用的VZV感染后细胞裂解液样品中含有游离的IE62抗原所导致的背景反应，随着时间延长游离抗原降解，背景反应逐步降低至阴性水平。因此，本研究选择感染后32 h作为检测时间点，建立了基于生物素标记的VZV-IE62单克隆抗体1B7与酶联免疫斑点技术VZV感染细胞检测方法(VZV-IE62 ELISpot)用于后续的VZV感染性滴度检测研究。

图3 基于抗VZV-IE62单克隆抗体1B7建立VZV的ELISpot检测方法Fig.3 Development of a VZV-ELISpot assay using anti-VZV-IE62 mAb 1B7Note: A.Representative images of VZV-IE62 ELISpot assay for live-VZV-infected (left),inactivated-VZV-infected (middle) and uninfected (right) ARPE-19 cells;B.The numbers of spots counted at indicated time points post-infection.

表1VZV-IE62ELISpot方法检测VZV病毒感染性滴度

Tab.1TitrationofinfectiousVZVusingestablishedVZV-IE62ELISpotmethod

Sample No.DFLinear range (log2N)Standard curve equationR2N50Titer (U/ml)11∶12.7004-10.2027y=149.42x + 12.6840.9962791.78 10521∶23.0875-10.8646y=74.504x + 28.6640.99541489.24 10431∶42.7004-10.0881y=32.012x + 20.4910.9920714.50 10441∶83.2479-11.0035y=21.159x-1.54950.99861252.09 10451∶162.7004-10.0741y=10.768x + 0.81150.99762731.08 10461∶322.1699-9.2796y=6.0480x + 9.88820.99431906.38 103

Note：DF.Dilution factor;N.Number of spots.

图4 VZV-IE62 ELISpot方法检测斑点数与病毒样品稀释度的关系Fig.4 Relation between number of detected spots and dilution factor of viral samples

2.3将VZV-IE62 ELISpot方法用于检测VZV感染性滴度 取一份预先应用经典空斑计数法检测滴度为1.6×105PFU/ml的VZV病毒样品，将该样品进行二倍比系列梯度稀释获得样品1～6(Sample 1-6)，参照试验方法1.2.8，将每个样品再进行4倍系列梯度稀释之后使用VZV-IE62 ELISpot方法进行检测。结果如图4所示，VZV-IE62 ELISpot方法检测斑点数量与样品稀释倍数呈现负相关趋势，并且在一定范围内表现为线性相关，因此认为该方法显色的斑点数与VZV病毒的感染剂量在一定范围内呈线性相关，能够用显色的斑点数计算病毒样品的感染性滴度值(U/ml)。本研究通过分别计算各样品线性区域对应斑点数与换算后加入的病毒原液体积的标准曲线，取线性区域的中位值N50，用于计算所检测样品的病毒的感染性滴度(U/ml)，具体如表1所示。

图5 VZV-IE62 ELISpot与空斑计数法的一致性分析Fig.5 Correlation between VZV-IE62 ELISpot assay and plaque assay

2.4VZV-IE62 ELISpot方法与空斑计数的检测结果一致性分析 为了验证本研究建立的VZV-IE62 ELISpot方法用于检测VZV感染性滴度的有效性，本研究进一步将表1获得的滴度结果与经典空斑计数法获得的滴度结果进行对比。结果如图5所示，两种方法获得的检测结果在5.00×103～1.78×105PFU/ml的范围内具有较高的相关性，R2达到0.990 3。上述结果说明，本研究建立的基于抗VZV-IE62单抗1B7与酶联免疫斑点技术的VZV感染性滴度检测方法与经典空斑计数法获得的检测结果具有良好的一致性，可用于VZV的感染性滴度检测。

3 讨论

水痘在全世界范围内均有流行，传染性极强，人群普遍易感，在1～9岁的儿童中发病率最高[22]；带状疱疹的发病率也呈逐年上升趋势，严重影响人类的健康状况[23]。目前，水痘与带状疱疹的分子致病机制还有待进一步深入阐释，二者目前也尚缺乏特效的治疗性药物，新一代的更为安全高效的预防疫苗也亟需发展。因此，开展VZV的相关基础与应用研究在公共卫生方面具有较为重大的意义。建立更为快速高效的VZV感染性滴度的检测方法对于支持开展相关研究是十分重要的。本研究基于VZV立即早期蛋白IE62与酶联免疫斑点检测技术，建立了一种新型的VZV感染性滴度检测方法。

首先，本研究制备了VZV-IE62的单克隆抗体。鉴于IE62的分子量较大，本研究采用合成多肽的形式，在保留部分免疫原性的同时能够降低抗原制备难度，缩短抗体制备时间，研究中成功获得13株抗VZV-IE62的单克隆抗体，通过ELISA评价筛选出其中具有较优免疫反应性和特异性的抗体1B7。之后，Western blot的检测结果显示1B7所特异性结合的蛋白与IE62的理论大小相符合；在免疫荧光的检测结果中，转染VZV-IE62表达质粒的293T细胞中的IE62只分布于细胞核，而在感染VZV的ARPE-19细胞中的IE62在细胞核和细胞质都有分布，这与文献报道的IE62的亚细胞定位相符合[24]。因此，确定1B7抗体可用于后续实验中VZV-IE62的特异性检测。

随后，本研究将1B7抗体用于酶联免疫斑点检测方法(VZV-IE62 ELISpot)，再结合生物素-亲和素放大系统，成功地将VZV感染细胞的检测周期缩短至32 h，实现了VZV感染细胞的快速检测。最后，本研究将所建立的VZV-IE62 ELISpot方法应用于VZV感染性滴度检测。通过检测梯度稀释后的VZV样品，统计各个稀释后样品的显色斑点数量，取斑点数量与稀释度线性相关的区域的中位值，计算获得原始病毒样品的感染性滴度(U/ml)，并且将该检测方法所获得的结果与空斑法获得的结果(PFU/ml)进行一致性分析，确定了两种方法在检测区间内具有较高的相关性。因此，本研究所建立的VZV-IE62 ELISpot方法可用于VZV的感染性滴度检测。

综上所述，本研究建立了一种新型快速的VZV感染性滴度检测方法，可进一步为VZV的新型疫苗、抗病毒药物和致病机制等研究提供有效支持。