血清miR-21及miR-155对急性肾损伤的诊断及预后评估价值①

钟开义 黎宝仁 张祖文 蓝 燕 苏佩琼 陈雪丽 苏显都

(海南西部中心医院肾内科，那大 571799)

急性肾损伤(Acute renal injury，AKI)是一种由多种病因导致的、涉及多学科领域的临床综合征，其在危重症患者中的发病率及病死率均较高，严重威胁着人类的生命健康[1,2]。微小核糖核酸(microRNA，miR)是一类小的非编码RNA分子，广泛参与细胞增生、凋亡、免疫炎性反应等多种机体生物学过程的调控[3]。近期的研究发现，miR-21及miR-155表达水平变化影响着肾细胞的增殖与凋亡，且与AKI的发生发展有关[4,5]。然而，关于血清miR-21及miR-155在AKI的早期诊断及预后评估的研究较少。本研究通过分析AKI患者血清miR-21及miR-155表达水平变化，并比较各指标对AKI患者的诊断及预后评估价值，旨在为寻找AKI新型诊断标志物及靶向治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2017年9月海南西部中心医院住院确诊的AKI患者118例作为研究对象，其中男75例，女43例，年龄21～78岁，平均(46.53±13.26)岁。排除标准：①住院时间<24 h，年龄<18岁；②既往有慢性肾脏病史，曾服用过肾损害药物，有尿路感染，接受过肾脏手术者；③恶性肿瘤，自身免疫性疾病者。另选择同期50例体检正常者作为对照组，其中男30例，女20例，年龄22～74岁，平均(44.85±10.43)岁。两组性别、年龄等一般资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准，并签署患者知情同意书。

1.2研究方法

1.2.1分组方法 AKI患者根据28 d的生存情况，将其分为存活组和死亡组。其中存活组76例，男47例，女29例，年龄(45.38±12.74)岁；死亡组42例，男28例，女14例，年龄(48.26±13.51)岁。记录所有患者入院时的体质指数(Body mass index,BMI)、平均动脉压、心率、体温、基础疾病、合并症、急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(Acute physiology and chronic health scoring systemⅡ,APACHEⅡ)等基本资料。

1.2.2AKI诊断标准 参照2012《KDIGO急性肾损伤临床实践指南》[6]制定的AKI诊断标准：肾功能在48 h内突然减退，表现为血肌酐(sCr)绝对值升高≥26.5 μmol/L；或sCr较基础值升高≥50%；或尿量减少，尿量<0.5 ml/(kg·h)，并持续>6 h。AKI分期：①AKI 1期：sCr升高达基线值的1.5～1.9倍，或升高值≥26.5 μmol/L，和(或)尿量<0.5 ml/(kg·h)，持续6～12 h。②AKI 2期：sCr升高达基线值的2～2.9倍；和(或)<0.5 ml/(kg·h)，持续≥12 h。③AKI 3期：sCr超过基线值3倍，或升高≥353.6 μmol/L或需要启动肾脏替代治疗，和(或)尿量<0.3 ml/(kg·h)，持续≥24 h，或无尿≥12 h。sCr检测试剂由宁波美康生物科技股份有限公司提供(苦味酸法)。

1.2.3qRT-PCR检测 抽取所有研究对象的空腹静脉血3 ml于无抗凝剂管中，轻轻颠倒数次后静置10 min，于室温2 500 r/min离心15 min，分2层，吸取上层血清400 μl转移至1个EP管中，-70℃保存。在ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)上进行实时定量PCR法(Real-time quantitative PCR，qRT-PCR)。参考血清microRNA快速提取试剂盒(北京诺博莱德科技有限公司)的使用说明书提取血清总microRNA。以U6为实验内参,microRNA逆转录反应体系：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。于ABI 7500型荧光定量PCR仪中行扩增和荧光信号检测，扩增条件为：95℃ 10 min 1个循环，95℃ 15 s、60℃ 60 s进行45个循环，实验重复3次。每个反应体系中荧光信号达到所设定的阈值经历的循环数即为Ct值，以U6为内参照，采用2-ΔΔCt法计算miR-21及miR-155的相对表达水平，其中ΔCt=Ct目的基因-CtU6。

2 结果

2.1死亡组和存活组临床一般资料比较 死亡组的sCr、APACHEⅡ评分明显高于存活组，差异有统计学意义(P<0.05)；而两组的性别、年龄、BMI、体温、心率、基础疾病、合并症及平均动脉压比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1死亡组和存活组临床一般资料比较

Tab.1Comparisonofgeneralclinicaldatabetweendeathgroupandsurvivalgroup

ItemSurvival group(n=76)Death group(n=42)χ2/tPSex(male/female)47/2928/140.2720.602Age(year,x±s)45.38±12.7448.26±13.511.1860.190BMI(kg/m2,x±s)24.38±2.7524.92±3.160.5140.608Heart rate(time/mim,x±s)83.62±9.2784.75±8.520.5060.617Temperature(℃,x±s)37.40±0.8537.86±1.040.6480.529History of diabetes[n(%)]13(17.1)8(19.0)0.0700.792History of hypertension[n(%)]17(22.4)12(28.6)0.5620.454Complication[n(%)]0.4260.408Sepsis32(42.1)19(45.2)Seriously infect21(27.6)10(23.8)Operation15(19.7)9(21.4)Other8(10.5)4(9.5)Mean arterial pressure(mmHg,x±s)85.42±9.5083.28±9.160.6910.497sCr(μmol/L,x±s)215.62±138.43287.40±165.725.1030.006APACHEⅡ score(score,x±s)16.52±6.2822.36±7.358.204<0.001

GroupsnmiR-21miR-155Control group501.06±0.210.36±0.05AKI group1182.92±0.741)1.95±0.421)AKI 1 phase532.48±0.521)1.60±0.251)AKI 2 phase372.81±0.661)1.87±0.361)AKI 3 phase283.85±1.301)2)3)2.73±0.851)2)3)

Note：Vs control group,1)P<0.01；vs AKI 1 phase,2)P<0.01；vs AKI 3 phase,3)P<0.01.

2.2各组血清miR-21及miR-155表达水平比较 AKI组血清miR-21及miR-155表达水平明显高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。AKI 3期血清miR-21及miR-155表达水平明显高于AKI 1期和AKI 2期，差异均有统计学意义(P<0.05)。AKI 2期血清miR-21及miR-155表达水平与AKI 1期比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3死亡组和存活组血清miR-21及miR-155表达水平比较 死亡组血清miR-21及miR-155表达水平明显高于存活组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4血清miR-21、miR-155及二者联合对AKI的诊断价值 血清miR-21及miR-155二者联合诊断AKI的AUC(95%CI)为[0.932(0.874～0.993)]明显优于miR-21[0.852(0.791～0.914)]和miR-155[0.826(0.764～0.890)]，差异均有统计学意义(Z=4.902、7.428，P<0.05)；血清miR-21诊断AKI的AUC(95%CI)与miR-155比较，差异无统计学意义(Z=1.108，P>0.05)。血清miR-21及miR-155诊断AKI的最佳界值分别为2.15、1.28，二者联合诊断AKI的敏感度较好，为96.2%。见图1和表4。

GroupsnmiR-21miR-155Survival group762.60±0.571.68±0.31Death group423.71±1.242.54±0.72t8.7356.419P<0.001<0.001

2.5血清miR-21、miR-155及二者联合对AKI患者预后的评估价值 血清miR-21及miR-155二者联合预测AKI死亡的AUC(95%CI)为[0.904(0.843～0.962)]明显优于miR-21[0.836(0.778～0.898)]和miR-155[0.807(0.749～0.868)]，差异均有统计学意义(Z=4.673、7.105，P<0.05)；血清miR-21预测AKI死亡的AUC(95%CI)与miR-155比较，差异统计学意义(Z=0.964，P>0.05)。血清miR-21及miR-155预测AKI死亡的最佳界值分别为3.35、2.16，二者联合预测AKI死亡的敏感度较好，为91.4%。见图2和表5。

表4血清miR-21、miR-155及二者联合对AKI的诊断价值

Tab.4DiagnosticvalueofserummiR-21,miR-155andtwoincombinationwithAKI

ItemOptimal cut-off valueStandarderrorAUC(95%CI)Sensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictivevalue(%)Negativepredictivevalue(%)positivelikelihoodratioNegativelikelihoodratioPmiR-212.150.0380.852(0.791-0.914)86.079.382.682.74.1550.177<0.001miR-1551.280.0450.826(0.764-0.890)83.577.080.479.63.6300.214<0.001Two combination -0.0160.932(0.874-0.993)96.278.381.693.54.4330.049<0.001

表5血清miR-21、miR-155及二者联合对AKI患者预后的评估价值

Tab.5ValueofserummiR-21,miR-155andtwocombinedtoevaluateprognosisofAKIpatients

ItemOptimal cut-off valueStandarderrorAUC(95%CI)Sensitivity(%)Specificity(%)Positivepredictivevalue(%)Negativepredictivevalue(%)positivelikelihoodratioNegativelikelihoodratioPmiR-213.350.0410.836(0.778-0.898)86.478.282.581.93.9630.174<0.001miR-1552.160.0480.807(0.749-0.868)82.074.677.378.63.2280.241<0.001Two combination-0.0250.904(0.843-0.962)91.475.878.688.53.7770.113<0.001

图1 血清miR-21及miR-155诊断AKI的ROC曲线Fig.1 ROC curve of serum miR-21 and miR-155 in diagnosis of AKI

图2 血清miR-21、miR-155及二者联合评估AKI患者预后的ROC曲线Fig.2 Serum miR-21,miR-155,and two combined ROC curves for evaluating prognosis of AKI patients

3 讨论

AKI是一种由不同病因所致的，以短时间内肾小球滤过率迅速下降为主要特点的临床综合征，对AKI的早期诊断和预后判断是目前肾脏病学研究的热点问题。microRNA是一种内源性的非编码微小RNA，其广泛存在于真核生物中，长度约为22个核苷酸，通过在转录后水平调控靶基因的表达，参与各种重要的生物学过程，如细胞增殖、分化和凋亡，病毒防御、肿瘤转移、血管形成及免疫应答等[7，8]。已有研究证实，microRNA在疾病期间及其疾病的不同阶段会出现表达量的变化，并且具有器官组织的表达特异性，因此microRNA具备作为疾病诊断标志物的特点[9]。最近的研究表明，miR-150的缺失可抑制心肌梗死诱导的小鼠急性肾损伤，同时缓解局部炎症和间质细胞的凋亡，这种作用可能是通过激活胰岛素样生长因子1受体完成的[10]。Lorenzen等[11]研究发现，在小鼠缺血再灌注损伤模型和肾移植患者的肾脏内皮细胞和肾小管上皮细胞中存在miR-24的高表达，在这两种细胞中过表达miR-24能够加重缺氧诱导的细胞凋亡，miR-24通过调节组蛋白H2A家族成员X促进缺血再灌注损伤的发生发展。另有研究显示，AKI患者miR-210表达水平较健康对照组明显上调，Cox回归及Kaplan-Meier曲线分析提示miR-210可以作为独立预测AKI患者28 生存率的生物标志物，在组织缺血中表达上调的microRNA，在AKI患者血清中也呈高表达，在随访中发现AKI患者的生存期及预后与外周血microRNA的表达有关[12]。本研究显示，AKI组血清miR-21及miR-155表达水平明显高于对照组，AKI 3期血清miR-21及miR-155表达水平明显高于AKI 1期和AKI 2期，死亡组血清miR-21及miR-155表达水平明显高于存活组。提示血清miR-21及miR-155表达水平与AKI患者的病情严重程度相关，可能参与AKI的发生发展。Saikumar等[13]研究表明在缺血再灌注模型中miR-21及miR-155在肾脏皮髓质中均出现明显变化，其中皮质中miR-155在24 h出现表达高峰，之后开始下降；而髓质中miR-21及miR-155的表达高峰出现在120 h，提示microRNA表达量变化与AKI相关。Du等[14]通过分析120例心脏体外循环术患者术后第1日早晨单个时间点的血浆和尿液中的miR-2l表达水平，发现miR-21表达量的上升程度与术后发生AKI的严重程度呈正相关性，甚至可以对患者是否需要行CRRT治疗进行预测，显示其具有诊断AKI的价值。由此可见，AKI的发生可能与细胞缺血缺氧、细胞凋亡等多种病理过程有关，miR-21及miR-155通过影响上述病理过程，产生细胞损伤作用，从而参与AKI的调控。

应用ROC曲线分析显示，血清miR-21及miR-155诊断AKI的最佳界值分别为2.15、1.28，二者联合诊断AKI的AUC优于miR-21或miR-155；血清miR-21及miR-155预测AKI死亡的最佳界值分别为3.35、2.16，二者联合预测AKI死亡的AUC优于miR-21或miR-155。相关分析显示，AKI患者血清miR-21水平与miR-155水平呈正相关。说明血清miR-21及miR-155对AKI的诊断及预后判断具有一定的价值，二者联合检测有助于提高AKI诊断及预后判断的准确性。Martino等[15]研究认为血浆miR-21水平并不随着透析而下降，提示血浆miR-21可作为AKI早期诊断及病情进展的生物标志物，并可用于预测心脏术后AKI的预后情况。马龙等[16]研究表明miR-21在肾缺血再灌注损伤的不同阶段及不同缺血时间会发生不同程度的表达量变化，可能是一种较传统生化指标更为优越的评估AKI的有效标志物。另有研究显示，miR-155在肾缺血再灌注损伤中发挥重要作用，与信号通路有关，在疾病发生、发展的不同阶段其表达谱亦存在差异[17]。由此可见，血清miR-21及miR-155水平与AKI的病情严重程度相关，有望成为一种新的AKI诊断、分类和预后判断的工具。

综上所述，血清miR-21、miR-155上调与AKI发生、发展有关，可作为AKI诊断及预后评估的新型生物标志物，二者联合检测有助于提高AKI诊断及预后评估的准确性，同时也为理解AKI发病机制及治疗靶点提供了新的角度。但本研究仍存在很多局限性，如临床试验较少、检测的microRNA数量少等，今后尚需更多系统的基础性研究来进一步验证。