云粳系列水稻品种分子身份证的构建

管俊娇，杨晓洪，王江民，张 鹏，黄清梅，白 洁，余志慧，张建华

(1.云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南 昆明 650205；2.云南省农产品质量安全中心，云南 昆明 650223；3.云南省农业科学院农业经济与信息研究所，云南 昆明 650205)

得天独厚的自然环境造就了云南省丰富的稻种资源，同时多样的民族文化又不断促进稻种资源的丰富和发展，使云南省成为中国栽培稻的遗传多样性中心[1-2]。利用丰富的水稻资源选育出了大量优良品种，其中以高产、优质、抗病、抗倒伏为特点的云粳系列新品种在云南省及周边省份得到了大面积推广应用。但随着品种数量的增多和频繁的种质交流，种子市场中的“多、乱、杂”现象和“品种同质化”现象并存，制假、售假事件时有发生，使国家和农民利益受到很大的损害，给品种管理和知识产权保护带来诸多困难。因此，快速、准确地鉴别品种显得尤为重要。

传统的品种鉴定方法为田间种植鉴定，主要依据形态学性状对品种进行鉴别区分。DNA分子标记技术由于不受环境条件的影响，可从分子水平上对品种的遗传特异性进行快速、准确地鉴定，克服了传统形态标记鉴定周期长、误差大、性状差异小的缺点[3-6]。其中SSR标记因具有多态性高、重复性好、共显性遗传和易于检测等优点[7]，被植物新品种保护联盟(UPOV)生物化学和分子技术工作组用作植物新品种保护最广泛应用的标记体系，也被广泛用于作物多样性分析及构建指纹图谱[8]。

作物分子身份证是品种特异识别的一个标准，以分子标记的多态性检测手段为基础，将 DNA 指纹进行数字化编码赋值[9]，利用最简引物组合实现作物种质资源最大程度区分[10]。自2007年起陆续开展了大豆[11-13]、桃[14]、高粱[15]、甘蓝型油菜[16]、梨[17]、萝卜[18]、葡萄[19]、苹果[20]等作物分子身份证的研究工作。在水稻方面，陆徐忠等[21]、颜静宛等[22]利用 SSR 标记分别构建了水稻杂交种或亲本材料的分子身份证，这些研究对水稻品种资源评价、利用和保护等起到了重要作用。但是对于遗传背景较相似的一系列品种的分子身份证构建还未见报道。

本研究以云南省农业科学院选育的35份云粳系列水稻品种为研究材料，采用SSR 分子标记技术和荧光测序技术建立云南省粳稻品种指纹图谱，筛选最佳引物组合，构建35份云粳系列水稻品种的分子身份证，以期用最简引物组合实现品种的最大程度区分，减少繁复的工作量和高昂的检测成本，为云粳系列水稻品种的快速识别提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取云南省7个育种单位近年来育成的163份粳稻品种、品系作为试验材料，其中包括35份云粳系列水稻品种。

1.2 DNA的提取

每份试验材料取100 粒种子，经催芽播种于苗床上，在塑料大棚内进行育苗。当幼苗长到四叶一心时，混合取20个单株的叶片，用改良的CTAB法[18]提取DNA。

1.3 SSR标记检测

依据国家农业行业标准[23-24]公布的水稻微卫星遗传标记，经过初筛选，在每条染色体上均匀选择1～3对，共30对SSR荧光标记引物用于遗传多样性检测。PCR总反应体系为10 μl，采用2×Mix混合液，10.0 μl的反应体积包括5.0 μl 2×Mix混合液、0.6 μl 5 μmol/L正向引物、0.6 μl 5 μmol/L反向引物、1.0 μl样品DNA、2.8 μl超纯水。扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃下延伸10 min，4 ℃保存。

扩增产物在毛细管荧光电泳系统AB 3730XL DNA 分析仪(Applied Biosystems，USA)上检测。用GeneMapper Ver.3.7(Applied Biosystems，USA)对原始数据进行统计和校正，读出每个位点每个样品的等位变异片段大小数据。

1.4 品种分子身份证的构建

用POWERMARKER Version3.25软件分析供试材料指纹图谱数据，获得引物多态性，并按非加权配对法(UPGMA)采用Nei’s遗传距离进行聚类分析。筛选出鉴别云粳系列水稻品种的核心引物，读取云粳系列水稻品种的核心SSR荧光标记的指纹数据，并对指纹数据进行数字化编码。再结合品种的基本信息利用二维码生成软件将编码字符串转化成每份材料独特的条码标识即分子身份证。

2 结 果

2.1 云南省粳稻品种SSR标记多态性

用30对SSR引物，对163份粳稻品种进行遗传多样性检测。检测结果(表1)表明，30个多态性位点共检测到等位基因207个，每对引物等位基因变幅为2～17，平均等位基因数为6.6。基因多样性指数变异范围为 0.024 4～0.823 9，平均为0.479 8；多态信息含量(PIC)的变异范围为 0.02～0.80，平均为0.44。其中，在RM8277、RM336、RM72、RM297和RM219等位点所检测到的多态信息指数较大。

表1云南省粳稻品种SSR标记遗传多样性参数

Table1ThegeneticdiversityparametervaluesofSSRmarkersinjaponicaricevarietiesfromYunnanprovince

位点 染色体等位基因数基因多样性指数多态信息含量(PIC)RM583160.510.46RM208250.710.65RM8277390.800.77RM471450.630.58RM274520.020.02RM190670.590.51RM3367140.820.80RM728120.740.71RM278950.150.15RM2581040.100.09RM2241150.460.39RM191260.140.14RM1160.700.65RM423260.620.56RM85330.460.39RM5514100.720.68RM267570.520.41RM253660.540.44RM432750.630.56RM331850.090.09RM219960.730.69RM3111040.210.19RM2091170.510.48RM171240.590.51RM13067130.710.67OSR28970.530.49RM2971170.750.73RM2221080.330.31RM2541180.700.65RM71021250.480.42

分子身份证的构建既要满足唯一性和可识别(鉴别)性，又要满足最简引物组合的要求，否则将会造成构建的分子身份证过于冗繁。因此，有必要单独对云粳系列水稻品种的指纹图谱进行分析，筛选可以区分供试品种的最简引物组合。云粳系列水稻品种SSR标记多态性分析结果(表2)显示，30对SSR引物在35份材料中共检测到等位基因133个，每对引物检测到的等位基因数为1～9个，平均为4个。基因多样性指数变异范围为0～0.74，平均为0.40；多态信息含量(PIC)的变异范围为 0～0.72，平均为0.36。在RM8277、RM336、RM1、RM551 、RM219 、RM1306和RM254等位点所检测到的遗传多样性参数值较大。对比表1和表2可知，对于不同的群体，引物的多态信息含量指数差异较大。

表2云粳系列水稻品种SSR标记遗传多样性参数

Table2ThegeneticdiversityparametervaluesofSSRmarkersinjaponicaricevarietiesofYunjingseries

位点 染色体等位基因数基因多样性指数多态信息含量(PIC)RM583160.280.27RM208240.420.38RM8277380.720.69RM471440.550.48RM274510.000.00RM190640.590.50RM336790.740.72RM72850.560.48RM278920.110.10RM2581030.110.11RM2241120.490.37RM191230.180.18RM1160.620.55RM423230.540.46RM85320.410.32RM551480.640.60RM267540.420.36RM253640.540.44RM432750.530.49RM331810.000.00RM219960.650.60RM3111020.060.06RM2091150.370.33RM171240.230.22RM1306790.670.64OSR28950.560.50RM297160.480.46RM2221040.460.40RM2541150.690.65RM71021230.470.40

2.2 鉴别云粳系列水稻品种的最佳引物组合

用 1 对 SSR 引物难以将全部云粳系列水稻品种分开，因此选取多态性信息含量较高的引物(RM8277、RM336、RM551 、RM219 、RM254、RM1)6对两两组合，分析其对云粳系列水稻品种的区分率。RM336和RM551引物组合分辨率最高，可以区分17个品种；其次是RM551 和RM1引物组合，可以区分 16个品种；再次是 RM336和RM219引物组合，可以区分 15个品种。根据 2 对引物组合的区分结果，继续增加引物组合的数量。在增加到 5 对引物时，可将全部云粳系列水稻品种区分开来，5 对引物为 RM8277、RM336、RM551、RM254、RM1。用以上5对引物对供试的163个云南粳稻品种进行分析，该组引物能把云粳系列品种与其他粳稻品种区分开来。于是利用这 5 对引物构建云粳系列品种的分子身份证，既满足唯一性和可识别(鉴别)性，又满足了最简引物组合的要求。

2.3 云粳系列水稻品种分子身份证编码

利用可将全部供试云粳系列水稻品种区分的 5 对引物进行扩增，构建分子指纹图谱，图1为云粳39号在5个 SSR 位点的分子指纹图谱。读取 35份水稻品种的5个 SSR 荧光标记的指纹数据，按标记所在染色体由小到大排序，即按照RM1、RM8277、RM551、RM336、RM254的顺序依次排列。例如，云粳39号的扩增产物在毛细管荧光电泳系统检测得到的片段大小(bp)为82/84、215/215、171/193、154/154、142/142(水稻为二倍体, SSR 扩增只有 1 条主带时，须重复记录一次)。随着条码技术的发展，尤其是二维码的出现，条码可容纳的数据量增加，因此直接用按顺序排列的片段大小作为品种的分子指纹信息(表3)。 再加上水稻品种的基本商品信息, 包括作物种类、品种植物学类型、品种繁殖类型、品种名称、生产经营者名称、审定区域和审定的年份。最后利用二维码技术将每份材料的按相同顺序排列的字符串转化成每份材料独特的二维码标识即分子身份证。例如：云粳39号的二维码分子身份证见图2，扫码后内容如图3。

图1 云粳39号水稻的5个SSR分子标记指纹图谱Fig.1 The SSR fingerprinting of rice Yunjing 39 at five SSR loci

3 讨 论

3.1 分子身份证核心引物的选择

分子身份证的构建既要满足唯一性和可识别(鉴别)性，同时要满足最简引物组合的要求，以免造成构建的分子身份证冗余。引物检测到的等位基因数、基因型数越多，PIC值越高，表明其区分品种的能力也越强，在分子身份证构建中具有的价值也越高[14]。SSR引物检测到的等位基因数与所用材料的遗传背景有关，对于不同遗传背景的群体，引物的多态信息含量指数差异较大，即引物区分品种的能力差异较大。因此，本研究单独对云粳系列水稻品种的指纹图谱进行分析，筛选可以区分供试品种的最简引物组合。筛选的 5 对核心引物组合可以把来自同一育种单位、遗传背景较近的云粳系列水稻品种有效区分，而且能把云粳系列品种与云南省目前主要粳稻品种区别开来，说明用这5对引物构建云粳系列品种分子身份证既保证了身份证的唯一性，又达到了以最少标记区分品种的目的，减少了指纹分析的工作量，可作为快速鉴别水稻品种的一种有效方法。

表335个云粳系列水稻品种分子指纹信息

Table3Themolecularfingerprintinginformationof35japonicaricevarietiesofYunjingseries

编号品种名称分子指纹(bp)1云粳9号82/82、196/196、191/191、141/141、169/1692云粳136号70/72、172/172、193/193、141/141、169/1693云粳1号82/84、196/196、193/193、141/141、171/1714云粳2号82/86、215/215、193/193、138/138、163/1635云粳3号79/82、212/212、193/193、157/160、171/1716云粳4号82/84、212/212、181/193、166/166、135/1357云粳5号82/84、215/215、191/191、151/154、135/1358云粳6号82/84、215/215、193/193、151/154、142/1429云粳7号82/84、215/215、193/193、138/141、163/16310云粳10号82/84、215/215、191/191、166/166、135/13511云粳12号82/84、212/212、193/193、166/166、135/13512云粳14号72/86、212/212、193/193、138/138、135/13513云粳15号82/84、212/212、193/193、163/166、135/13514云粳16号82/84、184/184、193/193、172/172、169/16915云粳17号82/84、212/212、193/193、163/166、163/16316云粳18号84/84、215/215、193/193、166/166、135/13517云粳19号84/84、190/212、193/193、166/166、135/13518云粳20号82/84、212/212、193/193、166/166、142/14219云粳21号84/84、212/212、193/193、166/166、135/13520云粳优1号84/86、199/199、191/191、141/141、142/14221云粳优5号82/84、199/199、191/191、163/166、142/14222云粳优8号82/84、212/212、195/195、166/166、142/14223云粳优9号82/84、212/212、195/195、163/166、142/14224云粳优10号84/84、212/212、191/191、166/166、135/13525云粳优15号82/84、212/212、193/193、163/166、142/14226云粳8号86/86、205/215、187/193、141/141、163/16327云粳25号84/84、212/212、187/191、166/166、142/14228云粳26号84/84、212/212、187/193、166/166、142/14229云粳29号82/82、215/215、187/191、154/154、135/13530云粳31号82/84、172/172、187/193、166/166、135/13531云粳32号82/84、212/212、187/193、138/138、135/13532云粳34号82/84、199/199、189/197、163/166、135/13533云粳36号79/82、190/205、189/197、166/166、135/13534云粳37号82/84、199/199、189/193、154/154、142/14235云粳39号82/84、215/215、171/193、154/154、142/142

图2 云粳39号的二维码分子身份证Fig.2 The molecular identity card of rice Yunjing 39

图3 云粳39号的分子身份证内容Fig.3 The contents of the molecular identity card of rice Yunjing 39

3.2 分子身份证的编码

目前构建分子身份证的编码方法主要有 3 类[9]，都是以给基因位点扩增 DNA 条带赋值为基础，按一定顺序进行编码，串联起来形成一组数据。不管研究者选择哪种编码方法，最终都要通过条码技术将其转换为可用机器识别的条码或二维码，才可利用扫描器进行扫描实现快速识别品种，摆脱人工读取字符串式分子身份证的麻烦。随着二维码技术的发展，一个二维码可容纳的数据大幅增加，加之荧光测序技术在SSR技术中的应用，SSR 扩增产物通过荧光测序的检测体系可以直接得出不同等位基因的片段大小[25-26]。本研究中直接用按序排列等位基因片段大小作为某一品种的分子身份标识，再加上该品种的基本商品信息，构成了此品种的分子身份证，使得使用者可直接获得不同品种之间分子差异，也省去了在有新等位基因出现时重新对带型编码的麻烦。

3.3 分子身份证的用途

分子身份证与指纹图谱的功能相同，但分子身份证原则上是以最少特异变异位点或标记为基础，提取每份种质特异的遗传信息，并通过数字化处理和软件分析建立分辨不同种质的字符串形式，以达到简单明了地区分品种间差异，在品种检索时更直观的目的[14]。本研究构建的品种分子身份证可以通过制作标签，标识于商品种子包装上，直接用于优良品种种子的防伪和溯源，使用者可用读码器获得品种信息。分子身份证对水稻品种识别鉴定,品种标识,假冒伪劣品种鉴定,品种推广等具有重要的意义和实际应用价值。