鸭骨骼肌TNNI1基因CpG岛区甲基化与mRNA差异表达

姬改革，束婧婷，单艳菊，章 明，屠云洁，巨晓军，刘一帆

(江苏省家禽科学研究所，江苏 扬州 225125)

在肌肉的收缩过程中，肌钙蛋白(Troponin I ，TnI)是重要的调节因子，定位于横纹肌，能够和肌动蛋白结合，抑制肌球蛋白ATP酶的活性，使肌肉保持松弛的状态。TnI基因包含3种亚型[1]，分别为慢速骨骼肌型肌钙蛋白或肌钙蛋白I 1基因(TNNI1)；快速骨骼肌型肌钙蛋白I(Fast skeletal muscle troponin I)或肌钙蛋白I 2基因(TNNI2)和心肌型肌钙蛋白 I( Cardiac troponin I)或肌钙蛋白I 3基因(TNNI3)。TNNI1和TNNI2在发育的早期，肌肉生成过程中可以相互转换，共同表达，之后分别被限制在慢和快肌纤维中表达[2-3]。TNNI3在心肌的表达具有特异性[4-5]。

骨骼肌肌纤维类型是影响肌肉品质的重要因素，通常认为慢肌比例较高的肉品质相对较好。在哺乳动物上的研究结果表明[6]，TNNI1基因在成年动物慢肌纤维中特异性的表达，在肉品质和脂肪沉积方面具有重要的作用。在鸡上[7]，有研究者发现TNNI1基因在蛋鸡肌肉中的表达量显著高于肉鸡。关于TNNI1的研究多集中在哺乳动物，家禽方面相关的研究较少。课题组前期研究发现，TNNI1基因可能在鸭肌肉发育中具有重要的作用。在人上的研究发现[8]，与肌纤维类型相关的MYH7B、MYH7、MYH8、MYH3等基因的CpG位点的甲基化程度在快收缩型肌纤维和慢收缩性肌纤维上具有显著差异。DNA甲基化是指在DNA序列没有发生改变的情况下，相应的基因表达发生改变，导致可遗传的表型变化。通常由DNA甲基化转移酶催化，将 S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基转移到胞嘧啶第5位C上，形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。基因启动子区在基因转录调控中具有重要作用,因此了解基因启动子区CpG位点在不同组织中的甲基化程度，有助于揭示基因在不同组织差异表达的调控机理。本研究拟采用染色体步移技术克隆鸭TNNI1基因启动子区序列，采用生物信息学方法分析其序列特征，采用荧光定量PCR技术检测TNNI1基因在不同类型肌肉(胸肌和腿肌)组织中的差异表达情况，采用BSP技术检测基因启动子区DNA甲基化水平差异，以期为进一步探讨鸭TNNI1基因在肌肉发育中的转录调控机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

所用试验动物高邮鸭来自江苏省高邮鸭集团种鸭群，随机选取健康的处于上市日龄(70日龄)的高邮鸭公母各5只。放血屠宰后，分离胸肌和腿肌组织，立即放入液氮速冻，然后转入-80 ℃冰箱保存。用于核酸的提取。

1.2 试剂

DNA提取试剂盒、pGM-T克隆试剂盒、SuperReal荧光定量试剂盒、QuantScript RT Kit购自天根生化科技有限公司，染色体步移试剂盒Genome Walking kit、TaqMax、DL2000 Marker均购自TaKaRa公司，EpiTect© Bisulfite kit购自Qiagen公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒Gel Extraction kit、质粒小提试剂盒plasmid Mini Kit购自中美泰和公司。DH5α感受态细胞为本实验室保存。

1.3 试验方法

1.3.1 基因5′侧翼区的克隆 按照DNA提取试剂盒的说明书，提取高邮鸭胸肌肌肉组织DNA。因鸭TNNI1基因DNA序列(NCBI登录号：NW_004676592.1)信息尚不完善，存在多个GAP区域，采用染色体步移的方法进行TNNI1基因5′侧翼区的克隆。染色体步移采用TaKaRa公司的染色体步移试剂盒，按照试剂盒的说明书进行。

首先需要对已知序列进行验证。根据鸭TNNI1基因序列(NCBI登录号：NW_004676592.1)，在TNNI1基因的CDS区设计引物P1，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。用1 %琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，并将扩增片段连接到pGM-T载体，鉴定为阳性的克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。获得的序列比对正确后，设计2条特异性引物SP1、SP2，进行下一步的延伸。以设计的2条特异性引物SP1、SP2和试剂盒提供的通用引物进行热不对称PCR反应。反应体系和条件参照说明书。以鸭基因组DNA为模板进行第一轮PCR反应，引物为SP1和试剂盒中的通用引物AP1～AP4，试验特异性反应的温度为65 ℃，延伸时间为3 min。第一轮反应的PCR产物稀释10倍后，作为第二轮PCR反应的模板进行第二轮PCR反应，引物为SP2和试剂盒中的通用引物AP1～AP4。分别取2轮PCR反应的产物5 μl，用1%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测，选择清晰的电泳条带进行胶回收纯化，将回收纯化的DNA连接至pGEM-T载体，转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆于含氨苄抗性的LB液体培养基中，振荡培养过夜，进行PCR鉴定。将鉴定正确的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。本试验所用的引物见表1。

表1鸭基因PCR扩增引物

Table1PrimersforduckTNNI1genePCR

引物名称 引物序列 (5'→3') 片段长度(bp)用途P1-FCGAAGCCACGATGCCAGAG1 094染色体步移P1-RGAGCTGGCTCAGGGACSP1CTCACCCACACCTCCCTGC2 239染色体步移SP2ACAGGGGTCTCGAGCACT2 192染色体步移TNNI1-FCTGCACGAGAAGGTTGAG109荧光定量检测TNNI1-RGCAGGTCAAGCACTTTGATβ-actin-FCAAATGCTTCTAAACCG-GAC151荧光定量检测β-actin-RAACCTTCACCATTC-CAGTTTTBSP-FTGTATATAAGAGGGGATTTGT-GT324甲基化引物BSP-RACTTCTCCCCAAAC-CTCTCT

1.3.2 序列分析 采用在线软件BDGP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测核心启动子区；利用在线软件AliBaba (http://www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html?)进行启动子区转录因子结合位点分析；利用在线软件MethPrimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)预测基因启动子区CpG岛。

1.3.3 CpG岛甲基化水平检测 提取高邮鸭胸肌和腿肌组织DNA，测定浓度后，取500 ng DNA，用亚硫酸盐对DNA进行处理，样本DNA未发生甲基化的胞嘧啶(C)被转化为尿嘧啶(U)，经PCR扩增最终变为胸腺嘧啶(T)，而甲基化的胞嘧啶则不变。处理的DNA纯化后，以此DNA为模板，进行BSP-PCR扩增反应。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，鉴定正确后，将BSP-PCR产物与T载体连接，转化感受态细胞DH5α后，涂板，随机挑取单克隆，用PCR法进行鉴定，鉴定为阳性菌的进行测序，每个转化板至少挑10个阳性克隆，用BiQ_Analyzer分析软件对DNA序列和测序序列进行比对，判断CpG位点是否发生甲基化，统计分析各个位点的甲基化程度。

1.3.4 荧光定量PCR检测 Trizol法提取高邮鸭胸肌和腿肌组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测质量和浓度。检测合格后，取2 μg总RNA，反转录为cDNA。以管家基因β-肌动蛋白基因(β-actin)为内参，检测TNNI1基因的相对表达量。荧光定量PCR扩增采用SYBR Green I法，反应总体积20.0 μl，反应体系如下：2×SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10.0 μl，上下游引物各0.4 μl(10 μmol/L)，cDNA模板2.0 μl，50×Rox Reference Dye 0.4 μl，加ddH2O 6.8 μl补足20.0 μl。反应条件为：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 60 s，共35个循环；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。每次反应均设空白样品为阴性对照，每个样品设置3个重复。相对定量的结果采用2-△△Ct法进行处理。

1.4 数据分析

运用SPSS 20.0软件中的t检验和Bivariate Correlation进行差异显著性检验和相关性分析。所有数据均以“均值±标准差”表示。

2 结 果

2.1 鸭基因5′侧翼区扩增

根据染色体步移试剂盒的说明，首先要对编码区已知序列进行验证。以鸭基因组DNA为模板，以P1为引物，进行PCR扩增，扩增得到1条特异性条带，如图1，结果与预测片段大小相一致，与引物源序列(NW_004676592.1)一致性为99%，说明验证的已知序列正确，可以据此已知序列设计特异性引物进行侧翼序列的扩增。分别以根据已知序列设计的特异性引物SP1和SP2和试剂盒中的通用引物AP1～AP4进行2轮热不对称PCR反应，第二轮PCR有清晰的条带(图1)，切胶回收，并进行测序。

M：DNA 分子量标准，DL2000；1：CDS区已知序列扩增结果；2：5′侧翼区序列扩增结果。图1 鸭基因5′侧翼区PCR扩增Fig.1 PCR products of duck TNNI1 gene 5′ flanking sequence

2.2 生物信息学分析

经NCBI BLAST比对，获得的5′侧翼区序列片段长度为2 078 bp，与鸭(NW-004676592.1)TNNI1基因启动子序列同源性达97%，表明所扩增序列来源正确。使用在线软件BDGP对启动子核心区域进行预测，结果发现该序列存在4处的核心区域(表2)，其中最有可能的核心启动子区是核心区1，而核心区1和核心区2，核心区2和核心区3之间存在区域重叠现象，灰色背景的碱基代表转录起始位点。

表2鸭基因核心启动子区域预测

Table2PredictionofcorepromoterregionofduckTNNI1gene

核心区起始位点终止位点分值启动子序列(5'→3')1-1 916-1 8660.99GCCTGTGGTTTAATACTCCCCCTCCGCCGCCGGGCCCCGCAGT-GCGCGGC2-1 890-1 8400.80 CCGCCGGGCCCCGCAGTGCGCGGCTCCGCTGACACCAGGCACCAC-CGAGG3-1 858- 18080.83 CACCAGGCACCACCGAGGTAAGAGGGGGCCCGGCCCCGGCTGT-GCTGCGG4-529-4790.90 TTGGGGTTGTTTAAAATGTTTCCCAAATTCGTGGGGATGCAAAAGGTTGA

斜体的碱基代表转录起始位点。

使用在线AliBaba 2.1程序，搜素 TRANSFAC 4.0 数据库，对获得的TNNI1基因5′侧翼区序列进行分析，发现多个Sp1(Specificity Protein 1)结合位点，CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer binding proteins, C/EBPs)结合位点。还预测到了E-box、SP1、八聚体结合蛋白-1 (Octamer binding protein-1，Oct-1)、核因子KB (Nuclear Factor-kB，NF-KB)、GATA1(GATA binding protein 1)、生肌调节因子MRF4(Myogenic regulatory factor 4)等转录因子结合位点。经在线软件Methprimer 对启动子区CpG进行预测(Criteria used: Island size>100， GC Percent>50.0，Obs/Exp>0.6)，结果显示,在-2 032至-1 833处存在1个200 bp的CpG岛，在-206至-87处存在1个120 bp的CpG岛(图2)。预测的启动子核心区1、核心区2、核心区3位于-2 032至-1 833处的CpG岛内，其中部分CpG位点正好位于预测的核心启动子区内。对CpG岛(-2 032～-1 833 bp)进行分析(图3)，发现其存在3个Sp1结合位点，1个CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPs)结合位点，同时发现转录因子如维甲类X受体β(Retinoid X receptor beta，RXR-beta)、叉头框转录因子M1 (forkhead box M1，HNF-3)、NF-KB、c-Myc(Transcriptional regulator Myc-like)等的结合位点。

图2 鸭基因5′侧翼序列CpG岛预测结果Fig.2 Prediction of CpG island in duck TNNI1 gene 5′ flanking sequence

数字代表核苷酸位置(以ATG为+1)，加粗字体和加方框的序列代表预测的转录因子及其结合位点，下划线代表预测的核心启动子位置，灰色背景序列为BSP检测的CpG位点，顺序依次为1～14。图3 鸭基因5′侧翼区CpG岛转录因子结合位点预测结果Fig.3 Prediction of transcription factor binding sites in duck TNNI1 gene 5′ flanking sequence CpG island

2.3 高邮鸭基因表达水平

高邮鸭胸肌和腿肌组织TNNI1基因 mRNA 表达水平如图4所示，腿肌组织TNNI1基因表达量显著高于胸肌近9倍，二者差异极显著(P<0.01)。

**表示胸肌和腿肌组织基因表达差异极显著(P < 0.01)。图4 鸭胸肌和腿肌组织TNNI1 mRNA表达情况Fig.4 The mRNA expression of TNNI1 in the breast and leg muscles of ducks

2.4 DNA甲基化分析

鸭TNNI1基因启动子区BSP扩增序列位于-1 964 bp至-1 641 bp区域内，全长序列为324 bp，包含整个预测的核心启动子区，共有14个CpG位点。从图5A中可以看出，总体上，胸肌的甲基化水平为52.66%，腿肌的甲基化水平为57.04%，二者差异不显著(P>0.05)。比较各CpG位点的甲基化水平，从图5B中可以看出，胸肌和腿肌各个CpG位点的甲基化水平在胸肌和腿肌中均无显著差异(P>0.05)。启动子区各CpG位点的甲基化水平与TNNI1基因的mRNA 表达量进行相关性分析，结果如表3所示，胸肌中CpG2、CpG6、CpG7、CpG11、CpG12、CpG13、CpG14与腿肌中CpG4、CpG5、CpG6、CpG7、CpG8、CpG10、CpG11、CpG12位点的甲基化水平与mRNA表达量均呈正相关(P>0.05)，其余各位点甲基化水平与mRNA 表达量呈负相关(P>0.05)；其中，胸肌CpG4甲基化程度与mRNA表达量呈显著负相关(P<0.05)。

3 讨 论

课题组前期通过RNA-Seq技术对不同品种不同日龄的鸭胸肌组织进行了差异表达基因的筛选，通过GO和KEGG分析发现TNNI1基因在品种间各个时间点都具有显著差异，推测TNNI1基因可能在鸭早期骨骼肌生长发育中具有重要作用。

图5 鸭基因启动子区CpG岛的总体甲基化水平(A)和单个位点的甲基化水平(B)Fig.5 Overall methylation level (A) and single locus methylation level (B) of CpG island in the promoter region of duck TNNI1 gene

表3鸭基因mRNA表达量与启动子区CpG岛单个位点的甲基化水平的相关性

Table3CorrelationanalysisbetweenTNNI1genemRNAexpressionandmethylationlevelofthesinglesiteofCpGislandinthepromoterregion

CpG位点相关系数胸肌腿肌P值胸肌腿肌1-0.066-0.1060.9340.89420.207-0.1050.7930.8953-0.042-0.1480.9580.8524-0.9970.2780.003**0.7225-0.1940.4700.8060.53060.2070.4770.7930.52370.4440.0630.7560.9378-0.5820.2780.4180.7229-0.395-0.0550.6050.94510-0.8640.7050.1360.295110.7590.4190.4520.724120.0420.5150.9580.485130.944-0.6930.0770.307140.156-0.7000.8440.300

为进一步深入研究其表达调控机制，本研究成功克隆了鸭TNNI1基因上游5′侧翼区序列2 078 bp。已有的研究结果表明[9]，在人TNNI1基因启动子的上游并未发现TATA-box和CAAT-box；在猪上[10]，研究发现TNNI1基因启动子上游同时存在TATA-box和CAAT-box调控元件，另外还预测到了E-box、SP1、Oct-1、NF-KB、GATA1/2/3、AP1等转录因子结合位点。本研究采用生物信息学技术，分析鸭TNNI1基因启动子上游序列发现，与猪上的研究结果一致，该序列存在多个C/EBP结合位点，另外还发现了SP1、RXR-beta、MRF4、GATA1、NF-KB、c-Myc等多个转录因子的结合位点。在人和猪的启动子区均未发现CpG岛(转录起始位点前3 000 bp)的存在。在鸭TNNI1基因启动子区-2 032～-1 833和-206～-87处各发现了1个200 bp和120 bp的CpG岛，推测鸭TNNI1基因的转录调控方式可能与哺乳动物存在差异。

通过软件预测分析，TNNI1基因启动子区包含了4个核心区，其中-1 916～-1 808区域内含3个候选核心启动子区。预测的核心启动子区正好位于CpG岛(-2 032～-1 833)内。CpG岛是易于发生甲基化的区域，启动子区DNA甲基化能够影响转录因子与DNA的结合，改变染色质的结构，调控基因表达。分析发现CpG岛所在的区域有1个C/EBP和3个SP1结合位点，另外还包含了RXR-beta、HNF-3、NF-KB、c-Myc等转录因子的结合位点。C/EBPalp与基因转录效率关系密切[11]。SP1能和GC盒相结合，也能与转录因子如YY1、TBP结合，参与基因表达的转录调控[12]。目前还没有TNNI1基因启动子区DNA序列甲基化影响基因转录调控方面的报道。

与胸肌相比，腿肌因为承担更多的运动功能，肌肉中慢肌纤维的比例高于胸肌。定量检测的结果表明，TNNI1基因mRNA表达量在胸肌和腿肌中呈显著差异，与哺乳动物中TNNI1基因在慢肌纤维中特异性表达[6]是一致的。采用亚硫酸氢盐测序法检测CpG岛中各CpG位点的甲基化程度，发现胸肌和腿肌的CpG岛的总体甲基化水平无显著差异。推测，预测的核心启动子区CpG岛的甲基化修饰可能不是影响鸭TNNI1 基因在不同类型肌肉组织差异表达的主要调控因素，可能存在其他的如组蛋白修饰、miRNA干扰等的调控方式。CpG岛中各个位点的甲基化水平与mRNA表达量进行相关性分析，胸肌CpG4位点的甲基化程度与mRNA表达量呈显著负相关，这与通常认为的，甲基化程度越高，基因表达会被抑制的观点是一致的。CpG4位点正好位于转录因子c-Myc的结合区域内。c-Myc能够抑制肌肉细胞的终端分化，而YY1的持续表达能够促进c-Myc的表达[13]；NF-KB能够通过调节YY1和肌纤维相关基因的转录沉默调节骨骼肌成肌细胞的分化。对启动子区序列进行分析，发现启动子区存在3个NF-KB和2个YY1的结合位点。CpG4位点可能通过甲基化修饰，影响相关转录因子的结合，参与鸭TNNI1基因的转录调控过程。

本研究克隆获得鸭TNNI1基因5′侧翼区序列2 078 bp，预测分析发现其含有2个CpG岛，其中1个CpG岛(-2 078～-1 695)位于核心启动子区，存在多个调控元件和转录因子结合位点，其总体甲基化水平与TNNI1基因表达水平无显著相关，其中CpG4位点可能通过甲基化修饰，影响鸭TNNI1基因在胸肌中的转录调控。