甘蓝晚抽薹基因BoFLC3克隆、序列分析和亚细胞定位

戴忠良，陈 丽，山 溪，秦文斌，肖 燕，朱建飞

(1.江苏丘陵地区镇江农业科学研究所,江苏 句容 212400；2.南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095)

甘蓝(BrassicaoleraceaL.)为十字花科芸薹属的重要蔬菜作物，在中国广泛种植。抽薹开花是其生产中重要的农艺性状。“先期抽薹”降低产品的产量和品质，是春季结球甘蓝生产的主要问题。培育晚抽薹品种是解决这一问题的根本途径[1-2]。

FLC是开花时间调控的开关基因，对拟南芥开花控制有决定性的作用[3-4]。该基因在白菜类作物中有4个同源基因，但这些同源基因如何调控抽薹，以及它们与其他主要的抽薹开花相关基因的相互关系尚不明确。FLC编码1个MADS-box蛋白,是开花的负调控因子，很多控制开花的基因功能都是通过调节FLC来实现的，对开花的抑制程度与其表达量呈正相关[4]。FLC可能通过阻遏开花信号途径来抑制植物的生殖生长。在拟南芥中，己经克隆到了一些与FLC同源的基因，如MAF5、FLM、MF2和FLK等，它们在植物开花过程中也起着负调控作用[5]。FLC及其同源基因抑制一组开花促进因子的表达，如FT和SOC1，这些因子的表达又能够促进一些分生组织特征基因LFY与AP1的表达[4]。FLC是开花调控过程中起决定因素的一个调控因子，它受GA、光周期、春化与自主途径的负调控，受FRI-依赖途径的正调控[6]。遗传与分子生物学研究结果表明，FRI自主途径可能是通过与SUF4等形成蛋白复合体结合到FLC启动子的区域，来影响FLC的染色体结构；春化可使FLC的第一个内含子和启动子区H3K9和H3K27二甲基化水平增加，使得FLC的染色体结构处于关闭状态，从而调控FLC的表达[7]。为了更好地利用这些基因对甘蓝抽薹开花进行调控，本试验克隆了与抽薹相关的基因BoFLC3的全长，并对其进行序列分析以及时空特异性表达和亚细胞定位分析，为进一步利用该基因进行甘蓝抽薹的调控提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 植物材料与菌株

供试甘蓝种子由镇江市农业科学研究所提供。大肠杆菌菌株JM109由本实验室保存，质粒载体pMD18-T、TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶、RNA酶抑制剂、dNTP、AMV反转录酶等均购自TaKaRa公司。RNA提取试剂盒(RNA Simply Total RNA Kit)购自TIANGEN BIOTECH公司；Biospin胶回收试剂盒(BioSpin Gel Extraction Kit)购自博飞公司；SYBRPremixExTaqTM试剂盒购自TaKaRa公司。

1.2 BoFLC3基因克隆

以甘蓝叶片cDNA为模板，参照甘蓝FLC3基因(GenBank登录号AAP31677)，设计正反向引物BoFLC3-F/BoFLC3-R(表1)，以反转录的cDNA为模板进行扩增反应。反应体系为25.00 μl，其中加入10×Taqplus buffer 2.50 μl，25 mmol/L MgCl21.50 μl，10 mmol/L dNTP 1.00 μl，10 μmol/L正向引物1.00 μl，10 μmol/L反向引物1.00 μl，菌液1.00 μl，灭菌H2O 16.75 μl，Taqplus DNA polymerase 0.25 μl(5 U/μl)。PCR反应程序为94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像分析系统进行拍照及分析。

表1甘蓝BoFLC3基因克隆引物

Table1PrimersforthecloningofBoFLC3geneinBrassicaoleracea

引物 引物序列 作用 BoFLC3-F5'-ATGGGAAGAAAAAAACTAGAAATCA-3'基因全长克隆BoFLC3-R5'-TCAGCTTCGGCTCCCGCAAGATTCT-3'BoFLC3-qF5'-ACCTTCTCCAAACGACGCA-3'荧光实时定量引物BoFLC3-qR5'-AGACAACGAGAAGCGCGATG-3'GAPDH-qF5'-TCCACCATTGATTCTTCTCTG-3'荧光实时定量内标引物GAPDH-qR5'-TCAGCCAAATCAACAACTCTC-3'

1.3 目的片段回收

目的片段的回收按照购自博飞公司的Biospin胶回收试剂盒(BioSpin Gel Extraction Kit)使用说明进行。参照TaKaRa生物公司的pMD18-T kit提供的方法，向10 μl的反应总体系中加入1 μl pMD18-T vector,4 μl回收并纯化的DNA片段以及5 μl Ligation solution Ⅰ，于16 ℃连接过夜。转化大肠杆菌。用高温高压灭菌的牙签挑取单菌落，将挑过菌的牙签置于2 ml LB液体培养基中，在37 ℃，200 r/min条件下振荡培养12 h。序列测定由南京金思特生物科技有限公司完成。

1.4 序列分析

通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)服务器，对核酸序列数据库进行BLAST搜索，寻找同源序列。将编码的氨基酸序列用NCBI提供的BlastP程序进行同源性分析，用DNAman软件对BoFLC3编码的氨基酸序列进行系统树分析，利用ProtParam[8]分析BoFLC3蛋白的理化性质，利用TMpred[9]和ANTHEPROT分析软件分析蛋白质的跨膜区域，利用ProtScale[8]分析蛋白质的亲水性区域，用SignalP v3.0[9]进行信号肽分析，利用SMART软件(http://smart.embl-heidelberg.de/)对甘蓝BoFLC3蛋白进行功能域预测分析，蛋白质二级结构预测和三维建模分别使用在线软件SOPMA(http://npsa-pbi.libcp. fr/cgi-bin/secpred-sopma. pl)和SWISS-MODEL完成。

1.5 实时定量PCR分析

将甘蓝材料播种于装有经过高温高压灭菌的基质的穴盘中，将穴盘置于光照12 h、黑暗12 h光周期的光照培养箱中，夜温20 ℃、昼温25 ℃下培养。待幼苗长至2片真叶时用于试验。本试验用GAPDH为内参基因(表1)，每个cDNA样品重复3次，根据标准曲线和定量报告进行试验体系评价和目的基因表达分析。使用Opticon MonitorTM 1.02软件(MJ Research)对BoFLC3基因相对表达含量进行分析。

1.6 亚细胞定位分析

利用Gateway技术，将上一步的PCR回收产物与入门载体pdonr221和表达载体pEarlyGate101分别进行BP和LR重组反应。转化大肠杆菌感受态，将有扩增产物且片段大小正确的克隆进行测序。测序验证后即获得重组质粒 (亚细胞定位载体) pEarlyGate101-BoFLC3-YFP。然后，利用液氮冻融法将重组融合表达载体pEarlyGate101-BoFLC3-YFP转入农杆菌GV3101。将含有表达载体pEarlyGate101-BoFLC3-YFP的GV3101农杆菌单菌落接种于含卡那霉素的YEB培养基中，28 ℃，180 r/min培养20 h。然后加入1%体积的菌液到同样的YEB培养基中，28 ℃，200 r/min培养至菌液OD600为1.0。在4 000 r/min下离心15 min，收集菌体细胞，用终浓度为10 mmol/L 的MgCl2，10 mmol/L MES (调节pH至5.7)，150 μmol/L 乙酰丁香酮的注射缓冲液重悬至OD600为1.0，室温放置5 h后，用1 ml的无针头注射器将含有pEarlyGate101-BoFLC3-YFP的农杆菌菌液注射烟草叶片，用H2B-RFP作为细胞核标记。注射后的烟草植株置于25 ℃，16 h/8 h的光/暗周期下培养3 d。在激光共聚焦显微镜下观察YFP荧光信号及H2B-RFP红色细胞核荧光信号，进行BoFLC3蛋白的亚细胞定位分析。

2 结果与分析

2.1 甘蓝抽薹相关基因BoFLC3的全长克隆及拼接

根据甘蓝BoFLC3基因序列设计引物，扩增出甘蓝BoFLC3基因片段。结果(图1)表明：该基因全长为570 bp。

M：DL2000。图1 甘蓝BoFLC3基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of BoFLC3 gene in cabbage

2.2 甘蓝抽薹相关基因BoFLC3序列的生物信息学分析

2.2.1 甘蓝BoFLC3蛋白的理化性质分析 对BoFLC3基因所编码氨基酸序列(图2)的理化性质进行分析得到，BoFLC3基因编码197个氨基酸，其蛋白质分子量为20 990；等电点为9.45，说明该蛋白呈碱性；负电荷氨基酸(Asp+Glu)26个，正电荷氨基酸(Arg + Lys)34个；摩尔消光系数0.219(胱氨酸全按半胱氨酸计)；该蛋白不稳定性参数46.88，属于不稳定蛋白；其脂肪系数96.93；平均亲水性(GRAVY)-0.521；序列N末端为Met，推测其半衰期在网状细胞中为30 h，在酵母中大于20 h，在大肠杆菌中大于10 h。

2.2.2 甘蓝BoFLC3编码的氨基酸序列同源性及进化树分析 在NCBI站点上用BLAST分析BoFLC3基因编码氨基酸序列与其他植物抽薹相关基因的同源性，结果(图3)表明，BoFLC3基因与已克隆的植物的抽薹相关基因均有不同程度同源性，与不结球白菜的控制抽薹基因碱基序列相似性高达94%，与拟南芥(同源蛋白编号AAV51217) 控制抽薹基因碱基序列相似性为79%。DNAman软件对BoFLC3及其他植物抽薹相关基因的氨基酸序列进行系统树分析，结果(图4) 显示，BoFLC3基因与不结球白菜最先聚为一类，亲缘关系最近，而后与萝卜聚为一类。与拟南芥(AAV51217)，白芥(ABP96967)亲缘关系相对较远。

图2 BoFLC3的核苷酸序列(上列)及其编码的氨基酸序列(下列)Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequences of BoFLC3

图3 不同植物BoFLC3基因编码的氨基酸序列同源性比较Fig.3 Alignment of predicted amino acid sequences of BoFLC3 genes from different plants

图4 不同植物BoFLC3编码的氨基酸序列的系统树分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the deduced amino acid sequences of BoFLC3 in different species

2.2.3 甘蓝BoFLC3蛋白疏水性及跨膜结构域的预测和分析 蛋白质的疏水性分析是蛋白质二级结构以及三级结构预测中一个必要的过程，通过分析可以得到蛋白质的亲疏水区域，一方面可以为二级结构预测结果提供参考，另一方面还可以为结构域以及功能域的划分提供依据。因此，对甘蓝BoFLC3氨基酸序列进行疏水性分析，结果 (图5) 表明，在该蛋白35～50 aa处有1个显著疏水峰，其他区域以亲水性为主。跨膜结构域是膜中蛋白与膜脂结合的主要部位，一般由20个左右的疏水氨基酸残基组成，形成α螺旋，与膜脂相结合。预测和分析跨膜结构域，对认识蛋白质的结构、功能、分类以及在细胞中的作用部位均有一定的意义。利用TMpred在线软件预测甘蓝BoFLC3蛋白的跨膜螺旋区域，该软件预测得分超过500的区域为可能的跨膜螺旋区域，符合该条件的区域为35～57 aa处膜外向膜内的跨膜螺旋(图6)，被赋予的分值为942(34～59 aa处膜内向膜外的跨膜螺旋，赋予分值为895)。跨膜区域位于膜结构中，应为蛋白质的疏水区域。上述预测的跨膜螺旋与ProtScale预测的蛋白质疏水区对应。因此，被预测的跨膜螺旋区可信度较高。

图5 甘蓝BoFLC3蛋白的疏水性分析Fig.5 Hydrophobicity analysis of BoFLC3 in Brassica oleracea

图6 甘蓝BoFLC3蛋白的跨膜螺旋区分析Fig.6 TMpred output for BoFLC3 in Brassica oleracea

2.2.4 甘蓝BoFLC3蛋白二级结构的预测分析 多肽链借助氢键排列成沿一维方向呈现有规则重复构象的二级结构，是氨基酸顺序与三维构象之间的桥梁。二级结构借助范德华力、氢键、静电和疏水等相互作用形成蛋白质的三级结构，从而发挥正常的生物学功能。据此，用SOPMA对甘蓝BoFLC3蛋白的氨基酸序列进行二级结构预测，结果 (图7) 表明，BoFLC3蛋白含有比较丰富的二级结构，由120个氨基酸残基组成α螺旋结构，占全部氨基酸残基的60.91%；24个氨基酸残基组成延伸链，占全部氨基酸残基的12.18%；由10个氨基酸残基组成β转角，占全部氨基酸残基的5.08%；由43个氨基酸残基组成随机卷曲，占全部氨基酸的21.83%。可以看出，随机卷曲和α-螺旋是BoFLC3多肽链中的主要结构元件，β转角和延伸链散布于整个蛋白质中。

图7 甘蓝BoFLC3蛋白质的二级结构 Fig.7 The secondary structure of BoFLC3 in Brassica oleracea

2.2.5 甘蓝BoFLC3蛋白的功能域预测分析 利用SMART软件对甘蓝BoFLC3蛋白进行功能域预测分析，结果(图8)表明，该基因为MADS盒基因，其编码的蛋白1～60 aa属于MADS盒基因蛋白，MADS-box基因是一个序列特异的调节基因家族，其编码的MADS-box蛋白转录因子以二聚体化的形式通过保守的MADS结构域与特定的DNA序列结合来调控基因的表达，通过反向平行的α-螺旋二聚体结构与DNA小沟相互作用。MADS-box基因编码一类转录调控因子，是一类调节植物发育的重要基因，在决定植物开花时间和花形态建成中起着非常重要的作用。

图8 BoFLC3蛋白的功能域预测分析Fig.8 Prediction analysis on functional domains of BoFLC3 protein

2.3 BoFLC3基因在甘蓝不同组织中的特异性表达

如图9所示，BoFLC3基因的表达在甘蓝不同组织中存在显著的差异，抽薹后，根中表达量最少，花蕾与花瓣中的表达量相近且略低于茎部中的表达量，叶片中表达量最高。

图9 实时定量PCR检测分析BoFLC3基因在不同组织中的表达Fig.9 Real-time quantitative PCR analysis of BoFLC3 gene expression in different tissues

2.4 亚细胞定位分析

将含有pEarlyGate101-BoFLC3-YFP的农杆菌侵染烟草植株36 h后，利用荧光共聚焦显微镜观察本氏烟叶片中的荧光。结果见图10，在激光共聚焦显微镜下，试验组pEarlyGate101-BoFLC3-YFP侵染烟草植株在YFP激发光下可以检测到较为明显的黄色荧光信号，红色荧光信号表示本氏烟植株细胞核位置；2张荧光信号重叠表明BoFLC3定位于细胞核，这与该基因发挥转录因子功能以及编码蛋白质的功能性质有关。

图10 BoFLC3在本氏烟叶片细胞中的定位Fig.10 Subcellular localization of BoFLC3 in leaves of Nicotiana benthamiana

3 讨 论

以拟南芥为模式作物，对其不同生态型和突变体的研究结果表明，基因FLC可能是春化反应的关键基因[6]。研究发现，FLC的表达水平与植株低温处理的时间呈负相关，低温处理时间越长，FLC的表达越弱，去甲基化也可能对FLC起负调控的作用[5-6]。同时FLC也存在于自主开花途径中，与其他基因共同作用以调节植株开花时间[10]。而FLC的表达对开花起抑制作用。一系列研究结果表明，春化的低温作用导致相关基因的去甲基化，消除了FLC对开花的抑制作用，从而解除对赤霉素合成途径的封锁最终导致植株在一定时期开花[11]。

本试验利用RT-PCR技术从甘蓝中克隆了BoFLC3基因，在NCBI站点上用BLAST分析BoFLC3基因编码的氨基酸序列与其他植物抽薹相关基因的同源性，结果表明BoFLC3基因与已克隆的植物的抽薹相关基因均有不同程度同源性，与不结球白菜的控制抽薹基因碱基序列相似性高达94%，与拟南芥(AAV51217)控制抽薹基因碱基序列相似性为79%。利用荧光定量PCR就BoFLC3基因在不同组织中的转录表达进行了分析，结果表明，该基因在甘蓝植物体内的表达有普遍性。低温处理后不同组织BoFLC3的表达量从高到低依次为：叶>茎>花蕾>花瓣>根。通过亚细胞定位分析，结果表明，BoFLC3蛋白定位在细胞的细胞核，这与BoFLC3的转录因子功能相吻合。

本研究利用PCR方法研究了甘蓝抽薹相关基因BoFLC3的时空特异性表达，通过亚细胞定位分析了BoFLC3在细胞中的表达,为下一步研究甘蓝中其他抽薹功能基因提供了经验和技术基础。