一个凤丹PoFAD2基因家族新成员PoFAD2-2的克隆及表达模式分析

孙 静，陈 明，孟家松，张克亮，陶 俊

(扬州大学园艺与植物保护学院/江苏省作物遗传生理重点实验室，江苏 扬州 225009)

脂肪酸去饱和酶(FAD)是植物脂肪代谢的关键酶，它能促使脂肪酸转化为不饱和脂肪酸。目前，人们已经通过对拟南芥等植物的研究，分离出多种参与脂肪酸去饱和代谢过程中相关酶的编码基因，分别为FAD2、FAD3、FAD6、FAD7、FAD8[1]。根据双键位置的不同，将其分为△9脂肪酸去饱和酶、△12脂肪酸去饱和酶和△15脂肪酸去饱和酶[2-4]。其中，△9脂肪酸去饱和酶是唯一可溶的去饱和酶，它仅包括硬脂酰(18∶0)-ACP去饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase，SAD)，△12脂肪酸去饱和酶和△15脂肪酸去饱和酶为膜蛋白[1]，编码△12脂肪酸去饱和酶的基因有FAD2、FAD6，编码△15脂肪酸去饱和酶的基因有FAD3、FAD7、FAD8[5-7]。

FAD2基因编码的△12脂肪酸去饱和酶是合成不饱和脂肪酸的关键酶，也是植物合成不饱和脂肪酸的限速酶。FAD2位于内质网膜上，主要催化脂肪酸链第12位和第13位碳原子之间形成双键，将油酸转化成亚油酸，使油酸能够进一步去饱和[8-10]。目前，人们已经从很多植物中克隆出FAD2的基因序列[11-18]，在拟南芥等少数植物中，只含有1个FAD2基因，而在其他大多数植物中发现有多个FAD2基因。如大豆中有4个，油橄榄中有2个，玉米中有3个。同一物种中FAD2基因不同，其作用也不尽相同。由于在种子油脂储存和植物质膜构成中均有多不饱和脂肪酸参与，因此可将不同FAD2基因分为种子储存油脂的种子特异型和维持细胞质膜脂肪酸代谢所需要的组成型2种。

凤丹(PaeoniaostiiT. Hong & J. X. Zhang)又名铜陵牡丹、铜陵凤丹，产自安徽省铜陵县凤凰山，芍药科芍药属，属于油用牡丹的主要品种。近年来，人们发现凤丹中α-亚麻酸含量特别高，作为一种新型的油料作物，分离牡丹植物中的FAD2基因，研究其表达模式是十分必要的。目前，少有研究报道凤丹PoFAD2基因的表达模式及功能，查阅文献后发现，宋淑香[19]曾做过一些研究。

本研究拟对PoFAD2新成员进行克隆和生物信息学分析，及其在植物体不同部位和时期的相对表达分析，以期进一步探究PoFAD2在凤丹中的作用，为牡丹种子高α-亚麻酸含量的进一步研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选用江苏省扬州市扬州大学牡丹种质资源圃(32°23′N，119°24′E)种植的凤丹为试验材料，采集盛花期的根、茎、叶、花、子房及种子(花后40 d、60 d、80 d、100 d、120 d)，立即置于液氮中速冻，-80 ℃超低温冰箱中保存备用。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，pMD19-T载体、TaqDNA聚合酶、快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、RNA提取试剂盒、荧光定量PCR试剂盒均购自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成 按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒说明书提取凤丹种子及叶片的总RNA，提取RNA后，取1 μl进行琼脂糖凝胶电泳，检测其质量及浓度，剩余的保存在-80 ℃冰箱中。cDNA第一链的合成利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa公司产品)完成。

1.2.2 引物设计 根据NCBI报道的凤丹转录组数据(登录号：SRP051810)，筛选到PoFAD2-1和PoFAD2-2 2个基因序列，利用Primer Premier5.0软件设计引物PoFAD2-1F：5′-CAATGGGAGCCGGTGGTCGAATGGC-3′和PoFAD2-1R：5′-ACTCGTTCCGATACCAAAACACACC-3′以及PoFAD2-2F：5′-ATTGTGGAACAATGGGTGCCGGTGG-3′和PoFAD2-2R：5′-TTATTCAAACTTATTCTTGTACCAG-3′，扩增凤丹PoFAD2-1、PoFAD2-2基因的开放阅读框(ORF)。

1.2.3 凤丹PoFAD2-2基因全长的获得 利用设计的引物对PoFAD2-1和PoFAD2-2的cDNA进行扩增，采用1%琼脂糖凝胶电泳对2次扩增的PCR产物进行检测，目的条带采用MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit试剂盒(TaKaRa公司产品)进行回收，然后采用pEASYTM-T5 Zero Cloning Kit试剂盒(全式金公司产品)进行TA克隆，转化至大肠杆菌感受态DH5α体内，然后进行抗生素(氨苄西林)筛选，抗生素质量浓度为100 mg/ml。最后将阳性克隆送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.2.4 生物信息学分析 cDNA全长的开放阅读框及编码氨基酸利用Bioedit软件来预测。利用生物学软件DNAMAN5.0进行序列的拼接和翻译，利用在线工具NCBI Blast进行序列的同源性比对，并采用MEGA5.0的邻接法(NJ)利用获得基因将凤丹与目前主要的几个油料作物进行系统进化树的构建。利用软件Prot Param、Prot Scale、TMHMM2.0、SMART分别对基因编码蛋白质的理化性质、亲疏水性、跨膜结构域、保守功能域进行分析。

1.2.5 基因表达模式的分析 利用荧光定量PCR仪CFX96 Reak Time System(Bio-Rad公司产品)，采用实时定量PCR(qRT-PCR)技术分析PoFAD2-2基因在凤丹根、茎、叶、花、子房和种子中的表达差异，并与PoFAD2-1做对比。实时定量PCR采用PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒(TaKaRa公司产品)，内参为凤丹的ubiquitin基因，特异性表达引物如表1显示。扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。使用Bio-Rad CFX Manager V1.6.541.1028软件收集反应的Ct值。每个样品重复3次，最终结果采用2-△△Ct法[20]进行计算。

表1凤丹PoFAD2-1、PoFAD2-2基因克隆所用引物及其序列

Table1PrimersandsequenceofPoFAD2-1andPoFAD2-2genecloning

2 结果与分析

2.1 凤丹PoFAD2-2基因克隆及序列分析

以凤丹叶片cDNA为模板，经PCR扩增后获得基因片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果与预期相符，测序后经Blast比对确定其为凤丹PoFAD2-2基因。序列分析结果表明，该基因OFR全长为1 155 bp，编码384个氨基酸，蛋白质分子量为44 000，等电点为8.51。

为对比PoFAD2-1与PoFAD2-2序列上的差异，用DNAMAN软件对PoFAD2-1及PoFAD2-2基因编码的氨基酸进行氨基酸组成与数目对比以及氨基酸序列比对(图1)。

表2显示，PoFAD2-1编码的氨基酸序列长度为383，酸性氨基酸及酰胺个数为52，碱性带正电荷的R基氨基酸个数为55。PoFAD2-2编码的氨基酸序列长度为384，酸性氨基酸及酰胺个数为50，碱性带正电荷的R基氨基酸个数为57。2个基因编码的氨基酸一致性为77.43%，相似性一般。

为了探讨凤丹PoFAD2-1基因、PoFAD2-2基因与其他植物同类基因的亲缘关系及可能的作用方式，用MEGA软件对PoFAD2-1和PoFAD2-2基因编码的氨基酸序列与柑橘、油茶、大豆、南瓜等已报道24个物种FAD2基因编码的氨基酸序列进行比对，构建Neighbor-Joining系统进化树，设定重复抽样次数为1 000。聚类分析结果(图2)表明，对于PoFAD2-1基因，凤丹在进化上与油茶[Camelliaoleifera(KJ995981.1)]、珙桐[Davidiainvolucrata(EU275211.1)]、毛果杨[Populustrichocarpa(Populusbalsamiferasubsp.trichocarpa) (XM_002297624.2)]、欧榛[Corylusavellana(KF856626.1)]、大豆[Glycinemax(soybean) (AY954300.1)]、大豆[Glycinemax(soybean) (BT098510.1)]的亲缘关系较近。对于PoFAD2-2基因，凤丹在进化上与油橄榄[Oleaeuropaea(common olive) (KY652929.1)]、靛木[Wrightiatinctoria(GU190864.1)]具有较高的相似性。PoFAD2-1与PoFAD2-2亲缘关系较远。

表2PoFAD2-1和PoFAD2-2基因编码的氨基酸组成及数目

Table2AminoacidcompositionandnumberofproductsencodedbyPoFAD2-1andPoFAD2-2genes

氨基酸 数目PoFAD2-1PoFAD2-2氨基酸 数目PoFAD2-1PoFAD2-2丙氨酸2325亮氨酸3837精氨酸1616赖氨酸1520天冬酰胺1310甲硫氨酸85天冬氨酸1721苯丙氨酸2025半胱氨酸66脯氨酸2625谷氨酰胺68丝氨酸2424谷氨酸1611苏氨酸1920甘氨酸2225色氨酸1312组氨酸2421酪氨酸2825异亮氨酸1618缬氨酸3330

图1 凤丹PoFAD2-1与PoFAD2-2蛋白质氨基酸序列对比Fig.1 Amino acid sequences comparison of PoFAD2-1 and PoFAD2-2

图2 凤丹PoFAD2-1和PoFAD2-2系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of PoFAD2-1 and PoFAD2-2

2.2 PoFAD2-2生物信息学分析

用NCBI软件对PoFAD2-2的保守结构域进行分析，用TMHMM软件对PoFAD2-2的跨膜结构域进行分析，结果(图3)表明，PoFAD2-2蛋白质属于膜结合型的FAD超家族，在第 105～110个氨基酸位点、第 140～145个氨基酸位点、第 315～320氨基酸位点3处共有3个可能的Fe2+结合位点，可能起催化作用。PoFAD2-2有5个跨膜结构域，分别为 49～71、81～102、179～196、223～245、250～272位的氨基酸，第5个跨膜区疏水性较强。

图3 PoFAD2-2编码蛋白质的保守结构域(a)和跨膜结构域(b)分析Fig.3 Analysis of the conserved domain of PoFAD2-2-encoded proteins (a) and transmembrane domain (b)

2.3 PoFAD2疏水性分析

利用Hydrophobicity ProtScale软件预测PoFAD2蛋白质的疏水性。图4显示，PoFAD2-2基因所编码的蛋白质疏水性最小为-3.244，最大值为2.744，说明该蛋白质为偏亲水性蛋白质。其中49～102、179～272位的氨基酸残基区域构成了2个疏水性区域，1～48、103～178、273～384位的氨基酸残基区域构成了3个亲水性区域。

图4 PoFAD2-2基因编码蛋白质的疏水性Fig.4 Hydrophobicity analysis of the protein encoded by the PoFAD2-2 gene

2.4 凤丹PoFAD2-1和PoFAD2-2基因在植株不同组织中的表达分析

采用qRT-PCR方法测量了PoFAD2-1和PoFAD2-2在凤丹根、茎、叶、花、子房、种子中的表达量，以及开花后40 d、60 d、80 d、100 d、120 d时PoFAD2-1和PoFAD2-2在种子中的表达量。图5显示，PoFAD2-1在凤丹的根、茎、叶、花、子房、种子中均有表达，而PoFAD2-2在根和子房中没有表达。PoFAD2-1主要在子房和种子中表达，PoFAD2-2主要在花和叶表达。随着种子逐渐成熟，PoFAD2-1和PoFAD2-2在种子中的表达量均是先降低再升高然后再降低，PoFAD2-1表达量在100 d升高，而PoFAD2-2表达量在80 d升高。PoFAD2-2在种子中不同时期的表达量均低于PoFAD2-1(图5)。

3 讨 论

脂肪酸有饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸又分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。油酸作为单不饱和脂肪酸同饱和脂肪酸一样能由人体合成，而亚油酸则需要从食物中获取。亚油酸是单不饱和油酸转化为多不饱和酸的第一步中间产物，因此，FAD2基因作为将油酸转化为亚油酸的关键基因，是非常重要的。

关于FAD2基因的研究很多，人们已经从芝麻、橄榄树、油茶、文冠果、油葵、黄瓜、油桐、花生等植物中克隆出FAD2基因，而且这些植物中大多不止1个FAD2基因。在黄瓜中发现了2个不同拷贝的FAD2基因[21]，从花生中分离出了6个不同拷贝的FAD2基因[22]。不同FAD2基因在植物体中的作用可能也不同。它们在序列特点、表达调控和功能机理方面都存在着显著差异[23-24]。王仲伟等[25]发现，油茶CoFAD2-2基因的表达模式比较特异，在开花后42周到44周之间(油茶种子趋于成熟)高表达，其他阶段表达水平一直维持在较低水平，尤其在种子成熟后期趋于更低水平的表达。Liu等[26]发现，在低温胁迫下，棉花FAD2-2基因表达量显著升高，而FAD2-3基因的表达则被抑制，FAD2-4和FAD2-5基因的表达量只是轻微上升。Hernández等[16]发现，油橄榄中的FAD2-1使幼小种子中储存的脂质去饱和，而FAD2-2使成熟的种子和中果皮中的脂肪去饱和。Suresha等[27]指出，FAD2在芥菜的所有组织中表达，在油的合成过程中受到调控。FAD2-1和FAD2-3-1在亚麻荠中的表达主要集中在花和种子上[28]。对花生中FAD2转录本分布进行分析，发现FAD2-1基因在发育种子中的表达量比FAD2-2基因高70倍，但是FAD2-2基因在花中大量表达[22]。

根据FAD2基因的位置和表达模式将它分为4种类型，即FAD2-1、FAD2-2、FAD2-3和FAD2-4。FAD2基因的4个变异显示出高度的序列相似性，但在脂肪酸修饰中的表达模式和功能存在差异[29]。FAD2-1是一种种子特异性去饱和酶，可合成幼苗和花芽中的多不饱和脂肪酸[30]。FAD2-2基因在大豆的营养组织和整个种子发育中呈组成型表达[31]。FAD2-2是负责亚油酸合成的主要基因[32]。几乎在所有组织中FAD2-3和FAD2-4均主要合成多不饱和脂肪酸。据报道，FAD2-3多肽与FAD2-4多肽具有98%的相似性[33]。

PoFAD2-1基因在花中表达量最低，在子房中表达量最高，在花后40 d、60 d、80 d、100 d、120 d的种子中PoFAD2-1表达量分别为PoFAD2-2的8.8倍、5.7倍、2.8倍、9.0倍、1.0倍，而且在种子发育进程中，刚开始表达量比较高，然后快速下降，在花后80 d时又开始上升，花后100 d又急剧下降。这与宋淑香[19]所测的凤丹PoFAD2-1荧光定量结果相似。PoFAD2-1基因表达量在种子发育100 d时开始急剧下降，这与凤丹不饱和脂肪酸含量在种子发育100 d时最高，随后不饱和脂肪酸含量又下降的趋势一致[19]。说明，PoFAD2-1基因确实是种子特异性基因。

本研究发现，PoFAD2-2基因在凤丹茎、叶、花、种子中均有表达，在根、子房中却没有表达，在种子整个发育期中的表达量都很低，在花中的表达量最高，说明此基因表达具有组织特异性。PoFAD2-2基因在种子发育进程中的表达趋势与PoFAD2-1相同。而PoFAD2-2基因在叶和花中的表达量都较高，分别是PoFAD2-1表达量的8.4倍、71.0倍。这可能是因为PoFAD2-2基因是负责亚油酸合成的主要基因。