绿原酸对鸡肉腐败菌的抑菌机理

苏萌萌，孙芝兰，刘 芳，吴海虹，张新笑，诸永志，王道营，徐为民,3,罗 章

(1.西藏农牧学院食品科学学院，西藏 林芝 860000；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；3.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095)

由微生物引起的食品腐败变质一直严重威胁着食品安全[1]。鸡肉作为优质的蛋白质来源[2]，由于其具有适宜微生物生长的pH、水分活度、营养成分等条件，所以在生产运输和销售等过程中很容易受到腐败菌的污染。鸡肉中的腐败菌种类众多，主要包括沙门氏菌、假单胞菌、腐生葡萄球菌、变形杆菌等[3-5]，严重影响着鸡肉的品质，所以控制微生物污染是保证肉品品质的重点[6]。

绿原酸作为植物体有氧呼吸的天然产物[7]，具有生物活性[8-9]。在不对食物造成任何有害作用的情况下，对多种腐败菌均有一定的抑菌效果[10-12]，这使得绿原酸作为生物防腐剂越来越受人们关注，然而绿原酸的抑菌机理尚不完全明了，亦无较系统的关于绿原酸抑菌机理的报道。据此，本研究就从杜仲中提取出来的绿原酸对鸡肉中主要的腐败菌(荧光假单胞菌和腐生葡萄球菌)的抑菌机理进行深入探讨，为绿原酸的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌种：荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)分离自市场上的冰鲜鸡肉。

培养基：营养肉汤培养基(NB) 由北京奥博星生物技术有限公司生产,营养琼脂培养基(NA) 由北京陆桥技术有限责任公司生产。

试剂：绿原酸由陕西慧科植物开发有限公司生产,ATP分析试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒、cFDA染料、PI染料由碧云天公司生产,diSC3(5)、valinomycin、nigericin 由Sigma公司生产,戊二醛由成都市科龙化工试剂厂生产。

1.2 仪器与设备

Ultra View VOX激光共聚焦显微镜购自珀金埃尔默公司，扫描电镜 EVOMA10/LS10 购自德国Zeiss Oberkochen公司，水浴锅购自国华电器有限公司，台式高速冷冻离心机购自德国Herolab公司，Anke TGL-16B离心机购自上海安亭科学仪器厂，LDZX-50KBS型灭菌锅购自上海申安医疗器械厂，JY5002型电子天平购自上海良平仪器仪表有限公司，SPX-250B-Z型生化培养箱购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂，SW-CJ-1FD型无菌操作台购自苏州净化设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化与培养 将指示菌接种于NB培养基中，37 ℃ 200 r/min摇床培养至对数期后重新转接到新的NB培养基中，重复此操作2到3次后，将菌种与灭过菌的体积浓度30%甘油以 1∶1的比例均匀混合，保存于-40 ℃的冰箱中。使用前，将冻存菌种解冻后，体积浓度2%接种于NB培养基中，37 ℃ 200 r/min摇床培养12 h备用。

1.3.2 最小抑菌质量浓度(MIC)和最小杀菌质量浓度(MBC)的测定 配制菌悬液：将体积浓度2%指示菌接种于NB培养基中，培养到对数期后收集菌株，重悬到生理盐水中,按10倍稀释后将菌悬液稀释到106CFU/ml。吸收0.5 ml加入到4.5 ml NB培养基中，用枪头吹匀待用。

MIC、MBC的测定：从配好的含10 mg/ml绿原酸的NB培养液中吸200 μl至96孔板中，采用二倍稀释法将绿原酸稀释到系列质量浓度 (0.1562 5～10.000 0 mg/ml)。在96孔板上每孔加100 μl不同质量浓度的绿原酸溶液和100 μl配制好的菌悬液，最终菌液为 5×105CFU/ml[13]。以NB培养液加菌悬液作为对照，每个试验重复3次，37 ℃培养24 h后测OD600，以抑制菌株生长的最低绿原酸质量浓度为MIC。在MIC的基础上，处理2 h时，从每孔中取10 μl混合菌液加到NA培养基上，37 ℃培养24 h后观察菌落生长情况。以杀灭99.9%细菌(未见菌落生长)的最低绿原酸质量浓度为MBC[14]。

1.3.3 扫描电镜 将已活化的指示菌按体积浓度2%接种于NB培养基中培养到对数期后，将1×MIC质量浓度的绿原酸加入菌液中作为处理组，同体积PBS缓冲液加菌液为对照组。37 ℃ 200 r/min摇床培养3 h后6 000 r/min离心10 min，用PBS缓冲液洗涤2次。将菌液固定于体积浓度2.5%的戊二醛缓冲液中，4 ℃ 24 h，2 500 r/min 4 ℃离心10 min，去上清液，加蒸馏水放置10 min再次离心，重复操作3次，以50%、70%、80%、90%的乙醇按顺序依次洗涤，每次洗涤后放置10 min，离心，加入100%的乙醇后放置30 min，将菌泥固定于镜片上，在通风橱中风干，喷金后在扫描电镜下观察、拍照[15-16]。

1.3.4 胞外ATP的检测 将已活化的指示菌按体积浓度2%接种于NB培养基中培养到对数期后，离心、用PBS缓冲液洗涤3次后，重悬到PBS缓冲液中。加入1×MIC质量浓度的绿原酸培养0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h后离心，取上清液待用。以未加入绿原酸处理的悬浮液作为对照。采用荧光标记法，具体操作步骤参照碧云天ATP试剂盒说明书。试验重复操作3次。

1.3.5 胞外蛋白质的检测 将已活化的指示菌按体积浓度2%接种于NB培养基中培养到对数期后，离心、重悬到PBS缓冲液中。加入1×MIC质量浓度的绿原酸培养0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h后离心，取上清液待用。采用Bradford法，利用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合的特点使溶液被染为蓝色[17]，测定595 nm处的吸光值，根据蛋白质标准曲线和样品的体积计算蛋白质浓度。以指示菌加PBS缓冲液作为对照组，试验重复3次。具体操作步骤参照碧云天Bradford蛋白质质量浓度测定试剂盒说明书。

1.3.6 膜电位的检测 采用荧光探针diSC3(5)测定指示菌细胞膜电位[18]。将已活化的指示菌按体积浓度2%接种培养到对数期后，离心、重悬到PBS缓冲液中。将0.5 mmoL/L的diSC3(5)加入到菌悬液中，放置15 min，向菌悬液中加入100 mmoL/L KCl用以平衡胞内外K+浓度。用移液枪各吸取1 ml上述菌悬液，加入1 μmoL/L valinomycin、nigericin和1×MIC质量浓度的绿原酸，取1 ml菌悬液作为空白对照。酶标仪测其荧光强度(ex=622 nm，em=670 nm)，每2 min测定1次，测定10 min。试验重复操作3次。

1.3.7 激光扫描共聚焦显微镜检测 将已活化的指示菌按体积浓度2%接种于NB培养基中培养到对数期后加入 1×MIC质量浓度的绿原酸，37 ℃ 200 r/min摇床培养1 h，以同体积PBS缓冲液加菌液为对照组。8 000 r/min离心3 min，去上清液后加入PBS缓冲液洗涤1次，离心。将菌体重悬在1 ml PBS缓冲液中，加入50 μl荧光探针cFDA，37 ℃孵育15 min，加入15 μl荧光染液PI，37 ℃ 孵育15 min，8 000 r/min离心3 min后将菌泥重悬在1 ml PBS缓冲液，重复操作3次，用移液枪吸取2 μl混合菌液于载玻片上，盖上盖玻片后在激光扫描共聚焦显微镜下观察、拍照。

2 结果与分析

2.1 最小抑菌质量浓度和最小杀菌质量浓度

试验结果如表1，绿原酸对于荧光假单胞菌、腐生葡萄球菌具有抑菌、杀菌作用。MIC和MBC均为5 mg/ml。

表1绿原酸对荧光假单胞菌、腐生葡萄球菌的MIC、MBC

Table1Theminimalinhibitoryconcentration(MIC)andminimalbactericidalconcentration(MBC)ofPseudomonasfluorescensandStaphylococcussaprophyticustreatedbychlorogenicacid

菌种MIC(mg/ml)MBC(mg/ml)荧光假单胞菌5.05.0腐生葡萄球菌5.05.0

2.2 绿原酸对菌种形态的影响

利用扫描电镜对微生物进行观察可以更直观地掌握微生物的形态[16]。如图1所示，未加入绿原酸的对照组中，荧光假单胞菌在电镜下呈饱满、圆润杆状，菌体完整，表面细滑有光泽，充满活力。经过绿原酸处理3 h后，荧光假单胞菌表面粗糙，大多数菌体扁平，色泽也变得暗淡，菌体变形严重，出现明显孔洞；未加入绿原酸的对照组中，腐生葡萄球菌在电镜下呈饱满的球状，菌体完整，色泽明亮，体态圆润。经过绿原酸处理3 h后，部分菌体色泽变暗，菌体表面有絮绒状结构出现，大多数菌体有凹陷和孔洞出现。说明绿原酸能够破坏荧光假单胞菌和腐生葡萄球菌的表面结构，使细胞受损严重。并且绿原酸对荧光假单胞菌的作用效果更强。

A：荧光假单胞菌；B：腐生葡萄球菌。图1 绿原酸处理后的荧光假单胞菌、腐生葡萄球菌扫描电镜结果Fig.1 SEM images of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

2.3 绿原酸对菌种细胞膜的影响

2.3.1 绿原酸处理对ATP流失的影响 胞外ATP来源于细胞的释放，其含量的测定直接可以说明细胞膜的受损情况[19]。ATP含量如图2所示，在未加入绿原酸的对照组中，荧光假单胞菌和腐生葡萄球菌的胞外ATP含量随着时间的增加均保持在50 nmol/ml以内，而在加入5 mg/ml绿原酸的处理组中，荧光假单胞菌的胞外ATP含量在处理1 h后明显呈上升趋势，在2.5 h内增加到263 nmol/ml；腐生葡萄球菌的胞外ATP含量在处理1 h后呈明显上升趋势，在2.5 h内增加到230 nmol/ml。结果说明绿原酸导致了荧光假单胞菌和腐生葡萄球菌细胞膜的受损，从而使胞内ATP流失。随着绿原酸处理的时间越长，细胞膜的受损情况越严重；相对于荧光假单胞菌，腐生葡萄球菌的耐抗性可能更强。

图2 绿原酸处理后荧光假单胞菌、腐生葡萄球菌的胞外ATP浓度Fig.2 Extracellular ATP concentration of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

2.3.2 绿原酸对胞外蛋白的影响 如图3所示，在未加入绿原酸的对照组中，2.5 h荧光假单胞菌和腐生葡萄球菌的胞外蛋白质量浓度分别为12.35 μg/ml和13.87 μg/ml。而在加入5 mg/ml绿原酸的处理组中，2.5 h荧光假单胞菌和腐生葡萄球菌的胞外蛋白质量浓度上升为321.25 μg/ml和330.79 μg/ml。由此可见，加入5 mg/ml绿原酸的处理组胞外蛋白质量浓度远远高于未加入绿原酸处理的对照组，说明绿原酸对荧光假单胞菌和腐生葡萄球菌的细胞膜有明显影响，通过改变细胞膜通透性导致细胞内蛋白质渗透到胞外，绿原酸处理的时间越长蛋白质渗透越明显。

图3 绿原酸处理后荧光假单胞菌、腐生葡萄球菌的胞外蛋白质量浓度Fig.3 Extracellular protein concentration of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

2.3.3 绿原酸对膜电位(△φ)的影响 利用荧光探针diSC3(5)测定指示菌的膜电位，当指示菌细胞膜破损时，diSC3(5)会渗透到胞外使测定的荧光量增强，膜电位发生变化。利用尼日利亚菌素(nigericin)能够保持细胞最大电位，缬氨霉素(valinomycin)能够完全破坏细胞电位的原理，将二者设置为阴性和阳性对照[20]。如图4、图5所示，A为荧光假单胞菌未加入绿原酸的对照组在测定的10 min内荧光值增加到2 784，而加入绿原酸的处理组在测定的10 min内荧光值增加到12 335；B为腐生葡萄球菌未加入绿原酸的对照组在测定的10 min内荧光值增加到2 720，而加入绿原酸的处理组在测定的10 min内荧光值增加到14 208。2种指示菌在加入绿原酸处理2 min后，荧光值迅速增加，这说明绿原酸造成荧光假单胞菌和腐生葡萄球菌细胞膜损伤，膜电位被严重破坏。

图4 绿原酸处理后荧光假单胞菌的膜电位Fig.4 The membrane potential of P. fluorescens treated by chlorogenic acid

图5 绿原酸处理后腐生葡萄球菌的膜电位Fig.5 The membrane potential of S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

2.3.4 激光扫描共聚焦显微镜观察 通过cFDA染料、PI染料对细胞荧光染色，二者渗入细胞的能力不同，在激光扫描共聚焦显微镜下,cFDA能够较容易穿过细胞膜，将健康细胞染色呈现绿色荧光；PI不能穿过完整的细胞膜，但能使致死细胞染色呈现红色荧光，而亚致死细胞在显微镜下将红色、绿色荧光叠加呈现黄色荧光[21]。如图6所示，A为荧光假单胞菌，B为腐生葡萄球菌。未加入绿原酸的对照组在显微镜下可以明显看到绝大多数的菌体呈绿色荧光，几乎没有菌体表面呈红色，这说明未加入绿原酸的对照组菌体健康，生长状况良好；加入绿原酸的处理组在显微镜下，可以看到荧光假单胞菌大多数菌体都被染成红色荧光，部分菌体呈现绿色和黄色荧光，腐生葡萄球菌也呈现出大量红色荧光。这说明经绿原酸处理后的2种指示菌细胞膜均有不同程度的受损，而绿原酸对荧光假单胞菌细胞膜的作用比腐生葡萄球菌更强一些。

A：荧光假单胞菌；B：腐生葡萄球菌。图6 绿原酸处理后荧光假单胞菌、腐生葡萄球菌在共聚焦显微镜下的状态Fig.6 CLSM images of P. fluorescens and S. saprophyticus treated by chlorogenic acid

3 结 论

本研究通过测定绿原酸对荧光假单胞菌和腐生葡萄球菌的最小抑菌质量浓度、最小杀菌质量浓度，利用扫描电镜观察细胞形态，对胞外ATP、蛋白质质量浓度的测定观察胞内大分子物质的泄漏情况，以及根据激光扫描共聚焦显微镜下观察的结果和膜电位的测定进一步验证膜损伤情况，深入探究绿原酸对鸡肉腐败菌(荧光假单胞菌和腐生葡萄球菌)的抑菌机理。得到以下结论：1)绿原酸对荧光假单胞菌和腐生葡萄球菌这2种指示菌具有抑菌、杀菌效果。2)绿原酸对2种指示菌的最小抑菌质量浓度、最小杀菌质量浓度为5 mg/ml。3)绿原酸是通过作用于2种指示菌的细胞膜，使细胞膜发生损伤从而导致胞内蛋白质、ATP等大分子物质泄漏，膜电位被破坏，最终达到抑菌、杀菌效果。