EZH2及其抑制剂在非小细胞肺癌研究中的进展

宫 颢，刘红雨，陈 军，

（1天津医科大学总医院肺部肿瘤外科，2天津市肺癌研究所，天津市肺癌转移与肿瘤微环境实验室，天津300052）

0 引言

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率占全球男性肿瘤患者死亡人数的28%，女性肿瘤患者死亡人数的26%，是世界性肿瘤相关性死亡的首要病因［1］。在我国，肺癌已成为75岁以上男性患者和60岁以上女性患者的主要死因［2］。其中以鳞癌和腺癌为主的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌总数的80%以上。尽管外科手术及放化疗等治疗手段较之前有了明显提高，但患者预后仍较差，5年生存率仅为15%［3］。大约70%的肺癌患者在肺癌切除术后会出现不同程度的转移及局部肿瘤复发。对患者进行基因检测、筛查与预后相关的肿瘤分子标记物能够更好地指导临床用药，从而延长患者的生存时间［4］。

随着分子生物学的发展，研究人员［5-6］发现肿瘤组织中除会出现特定基因位点改变及异常信号通路激活外，还会出现一些特殊的表观遗传性状的改变。表观遗传调控是一类重要的调控机制，通过改变所合成蛋白质的构象影响蛋白结构稳定性从而发挥作用。表观遗传调控在细胞的增殖、分化、凋亡，基因的表达调控及疾病的进展中均扮演重要的角色。常见的表观遗传学修饰包括基因的甲基化、乙酰化及磷酸化，组蛋白是其重要的修饰位点［5］。Zeste增强子同源物 2（enhancer of zeste homolog 2， EZH2）是一个重要的表观遗传调控基因，具有组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase， HMT）活性，能够对组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基（H3K27me3）催化从而抑制靶基因的表达［6］。EZH2基因最早发现于果蝇的体内，是果蝇发育基因关键抑制性调节因子［7］。随着研究的不断深入，科研人员发现在人体内同样也存在EZH2基因，且EZH2的表达异常与实体瘤（包括前列腺癌、乳腺癌、肾癌和肺癌）的不良预后相关［8］。EZH2基因在NSCLC中高表达，且表达水平与患者的预后密切相关。许多研究［9-13］也同时证实应用EZH2抑制剂能够有效降低NSCLC的侵袭和迁移能力，并能诱导肿瘤细胞凋亡，可见EZH2抑制剂具有良好的应用前景和临床价值。本文就近年来有关EZH2在NSCLC肿瘤防治研究中的最新进展及EZH2抑制剂的应用作一综述。

1 EZH2基因简介

EZH2基因位于人类染色体7q35上，属于PcG（Polycomb group）家族，是多梳蛋白抑制复合体2（polycomb repressive complex 2， PRC2）的重要催化活性亚单位，EZH2基因组共覆盖76 939 bp，包括20个外显子和19个内含子［14］。PcG蛋白是一种转录抑制因子，可以对染色体进行相应修饰，并参与基因的表达调控，在正常细胞和肿瘤细胞的生长、分化、衰老及凋亡等过程中发挥至关重要的作用，PcG蛋白包括PRC1和PRC2，其中PRC2核心成分包含EZH2、SUZ12（suppresso of zeste 12）和 EED（embryonic ectoderm development），EZH2只有与EED及SUZ12结合才能发挥其表观遗传修饰作用［15-17］。EZH2基因的N端有3个高度保守序列（Ⅰ区，Ⅱ区，富含半胱氨酸区）， C 端有一个由 Su（var）3-9、Enhancer of zeste、Trithorax组成的高度保守的 SET结构域（图1A）。EZH2的SET结构域具有S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-Adenosyl-L-methionine，SAM）及H3组蛋白N端的赖氨酸结合位点［6］。带正电荷的SAM以及带正电荷赖氨酸尾端的组蛋白与SET结合后，通过水介导的去质子化反应促使H3K27 ε-氨基活化，活化的 H3K27 ε-氨基可以进一步与甲基供体SAM反应从而生成S-腺苷-L-高半胱氨酸（S-Adenosyl-L-homocysteine，SAH）及H3K27me3（图1B）。EZH2基因在多种肿瘤包括小细胞肺癌（small cell lung cancer， SCLC）、NSCLC、前列腺癌、乳腺癌、淋巴瘤等中高表达，且其表达水平与肿瘤患者的预后相关［8］。Xu等［18］临床研究发现，在360例临床Ⅲ期和Ⅳ期肺癌患者中，有204例患者的癌组织EZH2表达为阳性；Kaplan-Meier生存分析曲线结果显示，这部分患者的生存时间要明显低于EZH2表达量低的患者，这表明EZH2有望成为评价和预测肿瘤患者预后的新型肿瘤分子标志物。

图1 EZH2主要区域和EZH2介导H3K27三甲基化示意图

2 EZH2在NSCLC发生发展和转移中的作用

2.1 调节肿瘤血管生成过程血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factors， VEGF）能够促使血管内皮细胞增殖，改变血管的通透性，是肿瘤生长中的关键调节因子［19］。EZH2能够调节 VEGF-A／AKT信号通路从而促进NSCLC的生长。Geng等［20］发现在NSCLC中，EZH2主要通过磷脂酰肌醇3激酶／蛋白激酶B（PI3K／AKT）通路来调节VEGF的生物学活性；在过表达EZH2的NSCLC细胞中，VEGF、磷酸化丝氨酸蛋白激酶 B（phosphorylated Ser473-AKT）会出现明显升高；而应用EZH2抑制剂或沉默EZH2时，VEGF及phosphorylated Ser473-AKT均会受抑制。与此同时，VEGF也能通过抑制血管生成负性调节因子的表达反向上调EZH2，从而增强血管的生成能力，促进肿瘤细胞的生长［21］。

2.2 抑制抑癌基因促进肿瘤生长及促进上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，

EMT）EZH2能与组蛋白去乙酰转移酶直接相互作用导致组蛋白去乙酰化，抑制肿瘤细胞相关抑制基因的表达。组织金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）是一种特异性的抑制性基质金属蛋白酶，能抑制基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的蛋白水解活性。 TIMP-3是TIMP家族中唯一能与细胞外基质紧密结合的成员，能抑制肿瘤血管生成、肿瘤细胞侵袭和转移。Xu等［13］研究发现在肺癌细胞中EZH2参与抑制转移抑制基因TIMP-3的转录，抑制EZH2的表达能够显著提高TIMP-3水平，抑制肿瘤细胞侵袭和转移。

EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为间质表型细胞的生物学过程，其在肿瘤转移中发挥重要作用。EMT主要的表现形式包括：E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达减少；细胞骨架由角蛋白向波形蛋白转化；细胞出现间充质细胞的特征等。Jiang等［22］发现在NSCLC中敲低 EZH2、EED、SUZ12、EMT相关转录因子（Snail和Slug）和间充质标记物（波形蛋白、N-钙粘蛋白、纤连蛋白和PAI-1）的表达会出现明显降低，而E-钙粘蛋白量明显增加，即EZH2同样也参与了NSCLC的EMT转化过程。

2.3 在肺癌中EZH2与miRNA之间的相互调控关系抑制EZH2能够通过其对应的miRNA发挥生物学功能。MiRNA是一种内源性小分子非编码RNA，由19～22个核苷酸组成，在细胞的增殖、生长和凋亡中起着十分重要的作用，其主要通过直接与靶基因3′端相对应mRNA配对，从而导致mRNA降解及蛋白翻译抑制，miRNA也同时参与肿瘤发生发展过程［23］。 Jiang 等［22］发现在 NSCLC 中，EZH2 是 mir-26a下游的靶点，且EZH2的表达与mir-26a呈现负相关，同时，mir-26a的下调能导致肺癌细胞对于铂类化合物的耐药，抑制EZH2可以通过上调mir-26a逆转铂类耐药；Sun等［24］研究结果显示 miR-4465在NSCLC细胞中下调，且miR-4465能够抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭，miR-4465是通过抑制EZH2进而发挥其肿瘤抑制的作用。

2.4 抑制NSCLC细胞凋亡PUMA基因又称为p53上调凋亡调制物（p53 upregulated modulator of apoptosis），能被p53迅速诱导从而产生强大的促细胞凋亡作用。PUMA蛋白属于Bcl-2蛋白家族中的BH3-only家族，由193个氨基酸残基组成，主要结构包括BH3结构域C末端跨膜结构域及N末端丝氨酸10号位磷酸化修饰位点三个部分［25］。PUMA可以通过BH3结构域与Bax的第一个α螺旋发生相互作用从而与凋亡效应蛋白Bax结合，直接活化Bax／Bak，产生细胞凋亡的作用。当各种病理因素积累时，PUMA基因会通过p53依赖通路或非依赖通路发挥促凋亡作用。Liu等［15］研究发现EZH2基因可以抑制Bax／Bak的信号通路从而进一步抑制肿瘤的凋亡。Follis等［25］的研究发现，在NSCLC中抑制EZH2基因表达能够明显上调PUMA，从而促进肿瘤细胞凋亡。

3 EZH2抑制剂的功能及应用

基于EZH2在肿瘤发生发展中的重要作用，研究人员已经研制出多种EZH2抑制剂并对其进行相应的体外实验及临床研究。图2总结了较为常用的EZH2抑制剂及其化学结构式。

图2 不同EZH2抑制剂的化学结构式

3.1 EZH2抑制剂的作用原理图3总结了两种常见EZH2抑制剂的作用原理。常用的EZH2抑制剂包括两类。一类为SAH水解酶抑制剂，其能阻断SAH水解为同型半胱氨酸及腺苷过程，达到间接抑制甲硫氨酸循环的目的，从而抑制SAM再生，最终通过旁路途径消耗EZH2及相关H3K27-me3，具有代表性的是DZNep（图2A）。DZNep是最早研制的EZH2抑制剂，能够导致SAH升高，间接抑制H3K27三甲基化的发生，诱导 EZH2、SUZ12、EED和 H3K27me3的降解［26］。另一类抑制剂则是通过竞争性抑制SAM发挥作用，抑制剂与SAM共同竞争在H3K27上的结合位点，导致SAM数量减少，SAM依赖的甲基转移酶受抑制，正常H3K27不能发生三甲基化反应，具有代表性的是 GSK126（图2B）、GSK343（图 2C）及EPZ005687（图2D）。随着药物研究的进一步发展，新型的 EZH2抑制剂——Tazemetostat（图 2E）和CPI169（图2F）也相继被研发出来。

图3 EZH2抑制剂作用示意图

3.2 EZH2抑制剂能够提升肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性EZH2抑制剂能够提升肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，增强药物的疗效。在SCLC中，EZH2在肿瘤细胞对化疗药物的获得性耐药过程中发挥着重要的作用。Gardner等［27］发现，化疗药物能够通过EZH2的转甲基作用导致H3K27me3在SLFN11基因上聚集，从而导致该基因部分染色质凝聚，抑制其表达。而在NSCLC中，应用EZH2抑制剂能够有效地提升具有BRG1和EGFR突变的NSCLC细胞对依托泊苷的敏感性［28］；抑制EZH2的表达能够有效逆转NSCLC对于铂类化疗药物的耐药性［15］；联合应用DZNep与组蛋白去乙酰酶抑制剂诺夫立他能够显著抑制NSCLC的增殖，诱导肿瘤细胞凋亡［26］。而在肝癌细胞中，应用EZH2抑制剂能够提升癌细胞对索拉西尼的敏感性［25］。

4 EZH2抑制剂最新相关临床试验

在动物体内应用EZH2抑制剂或应用EZH2与其他药物配伍，能够有效地减少肿瘤细胞的体积，而较对照组小鼠，体质量变化并不十分明显，且没有出现明显其他组织器官转移，可见在动物体内应用EZH2抑制剂 GSK2816126安全性相对较高［15，18，25-26］。 在复发 ／难治性弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma， DLBCL）、其他非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin's lyrnphoma，NHL）、转化性滤泡性淋巴瘤（transformed follicular lymphoma，TFL），实体瘤和多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）中已经完成了1期的临床试验，共有30例患者接受了EZH2抑制剂治疗，其中10例为DLBCL，2例为TFL，2例为其他类型NHL（滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤）和16例实体瘤，初步结果表明GSK2816126耐受性良好，没有观察到剂量限制性毒性（dose-limiting toxicity，DLT），最终在22名可评估的患者中，晚期生发中心来源的淋巴瘤（germinal center B-cell-like，GCB）及DLBCL的患者中观察到1位患者出现PR，7例患者病情稳定［29］。基于EZH2抑制剂的体内外实验结果，研究者已经将EZH2抑制剂应用于临床试验阶段，表1总结了近5年来EZH2抑制剂的相关临床试验。目前为止绝大多数的临床试验都是将EZH2抑制剂应用于血液系统肿瘤中，但值得关注的是，在2018年 3月 Pfizer公司将新一代 EZH2抑制剂PF-06821497应用于SCLC的Ⅰ期实验中。SCLC与NSCLC具有一定的相同点，肿瘤细胞的EZH2表达量明显高于正常肺组织，且应用EZH2抑制剂均能促使两种肿瘤细胞凋亡，抑制细胞周期，并能提升肿瘤细胞对于铂类药物的敏感性。但不同的是，SCLC对放化疗更敏感，应用EZH2抑制剂对于肿瘤细胞的杀伤能力会更强；且对于miRNA的互调作用方面，两种细胞对应的miRNA并不相同。但截至目前绝大多数临床试验处于志愿者招募或数据汇总阶段，还没有最新的临床试验结果汇报，但其结果拭目可待。

5 展望

NSCLC目前仍在威胁人类健康，尽管对其的治疗手段与种类较之前有了明显的丰富和提高，但患者预后并未得到显著的改善，5年生存率仍相对较低。最新研究发现在肿瘤细胞中除了会出现特定基因的改变外，还存在特殊的表观遗传学的改变。作为表观遗传学调控的核心分子，EZH2在NSCLC的发生、发展、转移及耐药中发挥着重要作用。EZH2抑制剂能够显著抑制肿瘤细胞的生长，抑制细胞周期，促进肿瘤细胞对药物治疗的敏感性，并诱导细胞凋亡，有望给NSCLC带来新的突破口。截至目前，EZH2抑制剂仍处在临床试验的阶段，但就其在体外及动物体内的研究结果来看，其未来在肺癌中的治疗前景十分广阔。

表1 不同EZH2抑制剂的临床试验总结