Jab1在乳腺癌细胞中对曲妥珠单抗敏感性的影响

沈倩，刘勇，于世英

(1.华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤科，武汉 430030；2.东南大学医学院附属徐州医院/徐州市中心医院肿瘤科，徐州 210000)

乳腺癌是危害女性生命的最常见肿瘤，近年来发病率不断上升。 人类表皮因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)是一个重要的原癌基因，编码具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体样蛋白[1]。HER2基因扩增导致肿瘤细胞表面HER2蛋白表达增加，从而使HER2受体活化[2]。在原发性乳腺癌患者中有25%～30%患者HER2过度表达[3]。目前研究表明，HER2是重要的乳腺癌预后判断因子，HER2过表达与乳腺癌侵袭转移密切相关，而且往往提示乳腺癌患者预后不佳[4]。曲妥珠单抗(trastuzumab)是一种人源化单克隆抗体，靶向作用于HER2受体，致使肿瘤细胞在G1阶段的生长终止，可以有效地抑制HER2过表达肿瘤细胞的增殖，是HER2过表达乳腺癌的最有效靶向治疗方式[5]。 尽管如此，对曲妥珠单抗的原发或继发耐药现象仍是临床上乳腺癌治疗的一大难题[6-8]。 目前研究显示， Jab1/CSN5(Jun activating binding protein) 作为COP9信号体的第5个亚单位，在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、头颈部肿瘤等实体肿瘤中发挥重要作用。笔者检测正常组织和乳腺癌组织中Jab1表达水平，分析其与临床病理特征的相关性，利用小干扰RNA(siRNA)技术敲除乳腺癌细胞中Jab1，观察Jab1对于导致HER2过表达乳腺癌对曲妥珠单抗治疗敏感性的影响。

1 材料与方法

1.1材料 人正常乳腺组织和乳腺癌组织标本来源于华中科技大学同济医学院附属同济医院病理科。人乳腺癌细胞(BT474、C5、C6)由华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤中心实验室保存。达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM/G)及RPMI 1640培养基购自Hyclone ；胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司，曲妥珠单抗(Ttzm，赫赛汀，Roche公司)，RIPA裂解液、LipofectamineTM3000脂质体(Invitmgen公司)，抗体Jab1及二抗(Santa Cruz公司)；Jab1 siRNA由Ambion公司合成。

1.2细胞培养和Jab1 siRNA转染 BT474细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM/G培养基；人曲妥珠单抗耐药乳腺癌细胞系C5、C6培养于含有10%胎牛血清及2 μg·mL-1曲妥珠单抗的DMEM/G培养基常规培养。根据LipofectamineTM2000说明书，将BT474和SKBR3以2×105·mL-1密度接种6孔板，每个细胞系分为两组：①转染空白siRNA的对照组；②转染Jab1 siRNA的实验组，每组分别使用100 pmol siRNA转染细胞6 h后，换新鲜培养基培养48 h，收集细胞进行相应实验。

1.33-(4，5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氨基苯基)-2-(4-磺苯基-2H-四唑)(MTS)实验检测曲妥珠单抗在乳腺癌细胞系中对细胞增殖的影响 MTS实验分为两部分，第一部分验证乳腺癌细胞系BT474及曲妥珠耐药株C5和C6的药物敏感性；第二部分检测Jab1敲低后，C5和C6耐药株对曲妥珠单抗敏感性的影响，每个细胞系分为两组：siNC空白组及Jab1 siRNA组，依据“1.2”项中实验步骤转染24 h后，用不同梯度浓度的曲妥珠单抗处理细胞。 两部分实验的药物处理时间均为72 h，药物梯度为12.5，25，50，100，200 μg·mL-1药物处理完毕后，用MTS法检测每孔中的细胞活性，计算并制作曲妥珠单抗的生长抑制曲线，并计算半数抑制浓度(IC50)。

1.4Annexin V/PI 双染法检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，消化计数后，将耐药株C5和C6细胞以细胞密度为2.5×105·mL-1接种于直径6 cm的细胞培养皿中，每个细胞系的实验分组如下：①空载体siRNA+二甲亚砜(DMSO)组；②空载体siRNA+曲妥珠单抗组；③Jab1 siRNA+DMSO组；④Jab1 siRNA+曲妥珠单抗组。第2天细胞贴壁后，依照“1.2”项所述，行细胞转染，24 h后，依分组加入5 μg·mL-1曲妥珠单抗或对应体积的DMSO，处理24 h后，收集每组中含有上清液里细胞的全部细胞，1000 r·min-1离心3 min，吸弃上清液，加入磷酸盐缓冲液(PBS)重悬漂洗细胞，再次以1000 r·min-1离心3 min，吸弃上清液PBS，加入凋亡抗体反应缓冲液100 μL，然后加入Annexin V 5 μL，于室温下避光反应5～10 min，于上机前加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)400 μL，用流式细胞仪检测每组中的凋亡细胞比例，其中Annexin V阳性/PI阴性的细胞为早期凋亡细胞，Annexin V阳性/PI阳性的细胞则为晚期凋亡细胞，统计这两部分细胞在整体细胞中的比例作为该组的凋亡率。

1.5定量聚合酶链反应(q-PCR)实验检测乳腺癌组织标本中Jab1表达 按流程提取RNA，并逆转成cDNA，在PCR仪上完成q-PCR，实验条件：变性温度为95 ℃，退火温度为55 ℃，Jab1引物序列如下：F：5′-GCAATCGGGTGGTATCATAGC-3′；R：5′-TGCGGATA-TTGTTCTTGTTGGA-3′，完成PCR取得每个标本CT值后，取曲妥珠单抗敏感中1例乳腺癌组织当做对照组，其Jab1表达记为1，依照公式：其他组织表达量倍数=2-△Ct，其中△Ct =其他组织CT值-对照组CT值，计算完毕后，使用Graphpad Prism 5.0制图，并计算两组间Jab1表达量的差异。

1.6Western blotting 检测Jab1水平 RIPA裂解液提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。每个样本取30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳，转印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脱脂乳封闭1 h，4 ℃一抗孵育过夜(Jab1 1：1000、β-actin 1：1000)。磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤3×10 min，室温二抗孵育1 h(1：3000)。PBST洗涤3×10 min，增强型化学发光试剂(ECL)法显色后显影成像，以β-actin作为内参。

2 结果

2.1Jab1在曲妥珠单抗耐药及敏感乳腺癌组织中的表达 26例使用曲妥珠单抗治疗的乳腺癌患者组织q-PCR结果显示，在曲妥珠单抗耐药的乳腺癌组织中Jab1的表达水平显著高于敏感的乳腺癌组织(图1)，耐药组中Jab1表达的平均值为敏感组的2.1倍(t=3.564，P<0.01)。

图1 Jab1在乳腺癌患者中表达情况

2.2Jab1在乳腺癌细胞株中的表达 Western blotting检测结果显示Jab1在曲妥珠单抗耐药株乳腺癌细胞C5、C6中的表达水平显著高于曲妥珠单抗敏感乳腺癌细胞系BT474(图2)，灰度值分析显示，C5和C6细胞系中Jab1在蛋白水平的表达分别是BT474细胞的18.3和15.1倍。

图2 Jab1在乳腺癌细胞系中的表达

Fig.2Jab1expressioninbreastcancercelllines

2.3Jab1敲除对曲妥珠单抗耐药性的影响 Western blotting检测结果显示，Jab1 siRNA 能够显著降低C5及C6细胞系中Jab1的表达(图3)，灰度值分析显示C5细胞系中，Jab1 siRNA 组中Jab1的表达为对照组的23.5%，而C6细胞系中，Jab1 siRNA组为对照组的45.6%。MTS结果显示，Jab1敲除后对曲妥珠单抗耐药的乳腺癌细胞株系C5 和C6重新对曲妥珠单抗敏感(P<0.05)(图4)。

2.4Jab1敲除对曲妥珠单抗治疗诱导的凋亡的影响 Annexin V/PI 染色结果显示，在Jab1敲除后的细胞系C5和C6，曲妥珠单抗导致的凋亡作用显著增强，在C5细胞系中，100 μg·mL-1曲妥珠单抗处理24 h后，Jab1敲除组与对照组凋亡率为(12.8±2.9)% 和(2.7±0.5)%(P<0.05)(图5)。而在C6细胞系中，Jab1敲除组与对照组的凋亡率分别为(18.8±3.6)% 和(4.1±1.1)%(P<0.05)(图6)。

图3 敲除后Jab1在C5和C6中的表达

Fig.3Jab1expressioninC5cellsandC6cellsafterJab1knockdown

图4 Jab1敲除后对C5和C6细胞存活率的影响

Fig.4ViabilityofC5cellsandC6cellsafterJab1knockdown

图5 Jab1敲除后对C5细胞凋亡的影响

Fig.5ApoptosisrateofC5cellsafterJab1knockdown

3 讨论

HER2是乳腺癌重要的预后判断因子，目前以HER2为靶点药物曲妥珠单抗在大部分HER2阳性的乳腺癌患者中取得了良好的疗效，改善了预后，但是在治疗过程中大部分患者发生了曲妥珠单抗耐药的情况，这也是目前乳腺癌治疗研究中的热点与难点。在乳腺癌中，HER2的过表达能够激活一些重要的信号通路，如MAPK及PI3K/AKT信号通路等，这些重要信号通路的激活能够促进肿瘤的增殖及侵袭。基于此现象，通过抑制这些重要通路来逆转曲妥珠单抗耐药取得了进展，动物实验及前期临床试验表明，以这些信号通路为靶点的药物联合曲妥珠单抗在HER2乳腺癌治疗中取得了一定疗效，但对HER2过表达乳腺癌曲妥珠单抗耐药的进一步研究仍然是必要的。Jab1/CSN5是COP9信号体的第5个亚单位，在许多恶性肿瘤组织中过表达的现象，包括乳腺癌、胃癌、结直肠癌、胶质瘤等，实验表明，Jab1对这些肿瘤的增殖及侵袭性有显著影响，因此Jab1在很多肿瘤中认为是一个潜在的治疗靶点，此外，HER2能够在转录水平激活Jab1从而在诸多肿瘤发生发展中发挥重要作用[9]。在乳腺中，HER2是重要的治疗靶点，HER2和Jab1的联系使得笔者做了大胆的假设，并研究Jab1在曲妥珠单抗耐药中是否发挥一定的作用。本研究结果显示，Jab1在曲妥珠单抗耐药乳腺癌患者组织中表达显著高于曲妥珠单抗敏感乳腺癌患者，同样的，在曲妥珠单抗耐药的乳腺癌细胞株C5和C6中，Jab1蛋白表达水平显著高于敏感组细胞株。这提示Jab1可能作为预测HER2过表达乳腺癌对于曲妥珠单抗治疗敏感性的有效预测指标。进一步利用RNA干扰技术敲除耐药细胞株中Jab1的表达，可见细胞株IC50明显下降。凋亡实验显示，Jab1敲除后增强了曲妥珠单抗诱导的凋亡作用。本研究结果提示，在乳腺癌中，Jab1过表达可能诱导其发生对曲妥珠单抗治疗耐药，虽然这一现象的具体机制需要进一步的研究，但是本研究对临床上逆转乳腺癌治疗中的曲妥珠单药耐药提供了新的思路。

图6 Jab1敲除后对C6细胞凋亡的影响

Fig.6ApoptosisrateofC6cellsafterJab1knockdown