长丝裂腹鱼温和气单胞菌的分离鉴定及药敏检测

雷雪平，耿 毅，邓龙君，甘维熊，黄小丽，陈德芳，欧阳萍

( 1.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130； 2.雅砻江水电开发有限公司，四川 西昌 615000 )

温和气单胞菌(Aeromonassobria)广泛分布于自然界，是一种常见的人—兽—鱼共患条件致病菌[1-2]，可致人类急性胃肠道感染[3]、创伤感染[4]和脑膜炎[5]等；也可感染尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)[6]、鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)[7]、黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[8]等多种淡水鱼类，引起腹水病[9]、皮肤溃疡[10-11]和出血性败血症[12]等；同时也对中华鳖(Trionyxsinensis)[13]、牛蛙(Ranacatesbiana)[14]、大鲵(Andriasdavidianus)[15]等两栖类和爬行类水生动物致病，给人类与水产养殖都造成较大的威胁。

长丝裂腹鱼(Schizothoraxdolichonema)，是长江上游的特有鱼类。近年来，由于梯级水电站的建立，破坏了河流的连续性，阻碍了鱼类的分布与洄游，加之人类大量的捕捞，导致长丝裂腹鱼资源量急剧下降，已被《中国物种红色名录》记录为濒危物种。2017年4月，西昌某养殖场养殖的长丝裂腹鱼暴发一种以出血和角膜发白为主要特征的疾病，导致长丝裂腹鱼的死亡率达20%。为探究此次发病之病因，自发病鱼体内分离纯化病原菌，获得病原菌优势菌株LXP170412。通过表型特征测定、16S rDNA与gyrB基因序列分析鉴定，菌株LXP170412为温和气单胞菌(Aeromonassobria)。进一步进行病原菌的药敏试验，以期为有效防治该病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

患病长丝裂腹鱼采自西昌某养殖场，具有明显临床症状，体质量352.5～674.7 g；健康长丝裂腹鱼购于四川攀西某养殖场，体质量(246.2±15.3) g。脑心浸液琼脂(北京欣经科生物技术有限公司)；MH培养基(杭州微生物试剂有限公司)；细菌DNA提取试剂盒、Mix、DNA分子Marker[天根生化科技(北京)有限公司]；药敏纸片(杭州天和微生物试剂有限公司)；细菌生化微量鉴定管(杭州微生物试剂有限司)。

1.2 病原菌的分离纯化

无菌条件下，自病鱼肝、脾、肾取样，划线接种于脑心浸液琼脂平板，28 ℃培养24～48 h，挑取形态、大小一致的单个优势菌落，于脑心浸液琼脂平板上再次划线，获得纯培养菌株，4 ℃保存备用。

1.3 人工感染试验

将获得的优势培养菌株LXP170412接种到脑心浸液琼脂平板，28 ℃恒温培养24 h，用无菌生理盐水洗下，用麦氏比浊法调整细菌密度分别为2.0×108、2.0×107、2.0×106、2.0×105cfu/mL。健康长丝裂腹鱼暂养7 d后，腹腔注射0.5 mL不同密度的菌液进行人工感染，对照组鱼注射等量无菌生理盐水，试验期14 d。攻毒后每日观察试验鱼的症状和发病死亡情况，对死亡鱼及时进行剖检和致病菌的再次分离。

1.4 病原菌菌株表型特性测定

观察分离菌的菌落形态，革兰氏染色观察细菌形态。挑取单个菌落接种于微量生化反应管，28 ℃培养48 h，根据生化鉴定管的说明书判定结果，并根据《常见细菌系统鉴定手册》[16]对菌株进行初步鉴定。

1.5 病原菌16S rDNA与gyrB基因序列测定及系统发育分析

使用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取新鲜细菌基因组DNA。采用一对扩增细菌16S rDNA基因的通用引物[17](上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)和gyrB基因通用引物[18][上游引物：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA(TC)GC(TCAG)GG(TCAG)GG(TCAG)AA(AG)TT(TC)GA-3′；下游引物：5′-AGCAGGGTACGGA TGTGCGAGCC(AG)TC(TCAG)AC(AG)TC(TCAG)GC(AG)TC(TCAG)GTCAT-3′]分别扩增16S rDNA基因与gyrB基因，预期扩增片段大小分别约为1500 bp与1200 bp。其反应体系与条件参照文献[19]。反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的大小并回收纯化。纯化后产物送成都擎科有限公司测序。将分离菌株的16S rDNA基因序列和gyrB基因序列GenBank中已知核酸序列进行Blast比对分析，分别调出与其同源性较高的序列进行多序列比对，用Mega 6.0构建系统发育树。

1.6 病原菌药物敏感性检测

采用纸片扩散法进行药物敏感性检测，将分离菌株接种于脑心浸液液体培养基中，28 ℃振荡培养 24 h，麦氏比浊法调整菌液密度为2.0×108cfu/mL，将菌液均匀涂布于MH平板上，贴上药敏纸片，28 ℃培养24 h，测量抑菌圈大小，并参照美国临床实验室标准化研究所抗菌药物敏感性试验执行标准(M100-S18)判定菌株对药物的敏感性。

2 结 果

2.1 临床症状及剖解检查

患病裂腹鱼主要表现为食欲减退甚至绝食，体色变淡，眼角膜混浊(图1a)，体表、鳍条基部、下颌及鳃盖等出血(图1a、b)。解剖病鱼发现，肝肿大、淤血，边缘钝圆，呈紫红色；脾肿大，呈暗红色(图1c)；肾肿大、出血(图1d)；鳔壁明显充血、出血；部分病鱼胆囊肿大、脂肪充血、出血，腹腔内少量腹水。

图1 长丝裂腹鱼感染温和气单胞菌的体征a.下颌出血，眼角膜混浊(箭头)； b.体表出血(箭头)； c.脾脏肿大(箭头)，鳔壁充血、出血； d.胆囊肿大，肾肿大，出血(箭头).

2.2 病原菌的分离与形态特性观察

自病鱼的肝、脾和肾组织中分离获得一株优势菌LXP170412。28 ℃培养24 h，分离菌株在脑心浸液琼脂平板上生长良好，形成圆形、表面光滑、半透明状、边缘整齐、略凸起、无水溶性色素的菌落(图2a)。经革兰氏染色镜检，菌体呈革兰氏阴性短杆状，两端钝圆，多数单个排列，无荚膜，无芽孢(图2b)。

图2 菌株LXP170412菌落形态(a)及革兰氏染色(b)

2.3 人工感染试验

注射菌液，2.0×108、2.0×107、2.0×106、2.0×105cfu/mL密度组在注射感染第2 d出现反应迟缓、游动异常、体表鳍基出血，并开始出现死亡，至试验结束时，各密度组死亡率分别为90%、60%、20%与10%，发病死亡鱼主要表现为体表与内脏器官的充血与出血，与自然发病鱼的临床特征相似，而对照组则在整个试验期内无任何异常。由人工感染发病死亡的长丝裂腹鱼体内再次分离细菌，获得与感染接种菌形态、理化特性与16S rDNA基因序列一致的菌株。采用寇氏法计算，分离菌对长丝裂腹鱼的半致死密度为1.002×107cfu/mL。试验结果表明，该分离株是此次患病长丝裂腹鱼的病原菌。

表1 菌株LXP170412人工感染试验结果

2.4 病原菌的理化特性

分离菌株LXP170412的主要生理生化特性见表2，它与温和气单胞菌生理生化特性基本一致，初步判定为温和气单胞菌。

2.5 病原菌16S rRNA与gyrB 基因序列测定及系统发育分析

采用扩增16S rRNA基因和gyrB基因的通用引物，扩增出分离株的16S rRNA基因和gyrB基因，分别得到预期大小的条带。纯化测序后分别得到长度为1410 bp和1107 bp的片段，GenBank基因登陆号分别为MG356656与MG356657，在GenBank中与已知核酸序列进行Blast比对，发现分离菌与温和气单胞菌的同源性最高，分别高达100%和98%。在基于分离菌的16S rRNA和gyrB序列与GenBank中同源性较高的气单胞菌属细菌16S rRNA及gyrB基因序列建立的系统发育树上，该分离菌株与温和气单胞菌聚为一族(图2、图3)。结合生理生化特性分析，确定菌株LXR170412为温和气单胞菌。

2.6 药物敏感性检测

温和气单胞菌LXP170412对18种抗生素的敏感性见表3。由表3可知，温和气单胞菌LXP170412仅对诺氟沙星、氧氟沙星、强力霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢噻肟6种药物敏感，对氟苯尼考、红霉素中度敏感，对新霉素、恩诺沙星、庆大霉素、罗红霉素、复方新诺明、四环素、丁胺卡那、青霉素、阿莫西林、头孢拉定10种药物耐药。

表2 分离株LXP170412的生理生化特性

注：“+”为阳性，“-”为阴性，“”为产酸产气，“d”为种间不同反应.

图2 基于16S rDNA基因序列构建的分离菌株LXP170412与相关菌株的系统发育树

图3 基于gyrB基因序列构建的分离菌株LXP170412与相关菌株的系统发育树

药物药物含量μg/片抑菌圈直径mm敏感性药物药物含量μg/片抑菌圈直径mm敏感性新霉素3012R四环素3010R恩诺沙星1024R环丙沙星522S诺氟沙星1023S红霉素1517I庆大霉素1012R丁胺卡那3013R氧氟沙星528S青霉素106R罗红霉素1512R阿莫西林106R氟苯尼考3017I头孢拉定3010R强力霉素3016S头孢噻肟3041S左氧氟沙星524S复方新诺明23.756R

注：“R”为耐药，“S”为敏感，“I”为中度敏感.

3 讨 论

温和气单胞菌广泛存在于水环境中，可引起鱼类及其他水产养殖动物多种疾病，是一种重要的条件致病菌[10]。据报道，该菌可以感染黄颡鱼[20]、大麻哈鱼(Oncorhynchusketa)[21]、河鲈(Percafluviatilis)[22]、西伯利亚鲟(Acipenserbaerii)[2]等多种养殖鱼类，并引起大量死亡，也能引起牛蛙溃疡症[14]和鳖败血症[23]。本研究自临床症状表现为体表出血与眼角膜浑浊的自然发病长丝裂腹鱼体内分离到一株革兰氏阴性杆菌，并通过其表型和分子生物学特性鉴定其即为温和气单胞菌，人工感染证实，温和气单胞菌自然情况下也可感染并致死长丝裂腹鱼。在长丝裂腹鱼的养殖中应重视温和气单胞菌所造成的危害。

近年来，就温和气单胞菌、维氏气单胞菌、嗜水气单胞菌等条件性致病菌对水生动物具有强致病性不断见诸报道[24-29]，条件性致病菌感染已成为威胁我国水产养殖的重要疾病之一。对于这些条件致病菌感染的发生机制，尤其是水质环境因素在其感染与致病中的作用尚不完全清楚，在本次取样时发现，发病场池塘的底质较厚，水体有机质含量较高，这是否与本次温和气单胞菌感染致病有关值得进一步研究，以便为更好的防控这些条件性致病菌的危害提供依据。长丝裂腹鱼自然感染温和气单胞菌后，临床症状主要表现为反应迟钝、食欲减退，体表褪色，肌肉与鳍条充血、出血；内脏器官淤血、出血，呈明显的败血症状。与罗非鱼[30]和金鱼(Carassiusauratus)[31]感染温和气单胞菌的症状相似，但也与嗜水气单胞菌[32]与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)[33]等感染的临床表现较为相似，给临床诊断带来困难。因此，提高鱼类疾病诊断的准确性应强化实验室诊断的作用。

温和气单胞菌LXP170412虽然对诺氟沙星、氧氟沙星、强力霉素、左氧氟沙星、环丙沙星等药物敏感，但我国相关法规已明令禁止诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星与环丙沙星等喹诺酮类药物在食用动物养殖中的使用；同时该菌对动物专用的恩诺沙星、氟苯尼考等耐药或中度敏感。在本次病例中养殖者曾用恩诺沙星进行内服治疗，结果无效，改用强力霉素才有效控制了疫情。由此可见，临床用药应根据药敏试验结果选择用药，以提高用药的有效性，避免药物滥用。另外，温和气单胞菌是一种广泛分布于水环境中的条件致病菌，其感染往往与水温、水质、养殖密度、应激等有关[34]，因此，在养殖环境控制与饲养管理上也应进行相应的改善工作以降低该病的发生风险。