骏枣果实成熟过程中果胶和纤维素代谢及其基因表达

李 欢，张舒怡，张 钟，张春梅，李新岗

(1 西北农林科技大学 林学院，陕西省林业综合重点实验室，陕西 杨凌 712100；2 四川攀枝花苏铁国家级自然保护区管理局，四川 攀枝花 617000)

枣(ZiziphusjujubaMill.)是我国原产特有果树，按照用途主要分为制干和鲜食两大类[1]。与鲜食枣相比，制干枣果实有一个变软和后熟的过程(完熟期)，因此具有较长的成熟期。骏枣是我国栽培面积最大的制干枣品种，主要分布在包括新疆南疆、甘肃、宁夏、陕西在内的西北枣区和山西骏枣原产区[2-4]。果实细胞壁的结构和物质组成对于果实质地变化及成熟软化具有直接影响，特别是由果胶、纤维素、半纤维素构成的细胞壁骨架的改变和含量影响较大[5]。因此，研究骏枣果实成熟过程中的质地变化、细胞壁代谢及其基因表达特性，对枣果适时采收和采后处理具有重要的指导意义。

果实成熟和质地变化与细胞壁结构及多糖物质(如果胶、纤维素、半纤维素等)的变化、降解密切相关，而细胞壁结构和成分的改变则与一些水解酶或调控酶，如多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶酯酶(PE)以及纤维素酶(Cx)、半纤维素酶等的活性直接相关[6-7]。果实成熟早期，主要是半纤维素降解，细胞壁空隙增大，水解酶扩散加快，果实硬度降低；果实成熟后期(软化)，主要是果胶物质(多聚半乳糖醛酸)降解，其中PG、PE等酶的共同作用可使不溶性果胶溶液化[5]。目前，对于枣果实成熟和软化的研究主要集中在冬枣、梨枣等少数鲜食枣品种采后的细胞壁代谢相关物质和酶类变化等方面，而有关采前枣果实发育和成熟生理及其基因组、转录组的研究还较少。有研究发现，枣果实的质地变化与细胞壁多糖降解相关[8-9]，果实成熟和采后软化与PG、果胶甲酯酶(PME)和纤维素酶等细胞壁代谢酶类的作用密切相关[10-11]。前人已从冬枣和梨枣中克隆出木葡聚糖内糖基转移酶(XTH)基因和β-半乳糖苷酶基因，这2类基因与枣果实质地和采后软化相关[12-13]。对枣转录组的研究也发现，一些细胞壁修饰酶基因，如β-半乳糖苷酶、XTH、内切葡聚糖酶和PG等的基因家族参与了枣果实成熟调控[14]。但是，枣果实成熟和软化的关键因子及其基因调控机制还不清楚。

为探究制干枣果实成熟过程中细胞壁物质和相关酶类的动态变化规律及相关基因的表达调控机制，探明枣果实成熟和软化的关键因子，本研究以制干枣品种骏枣为材料，测定果实成熟过程中果实硬度、含水量、可溶性固形物含量、细胞壁物质(果胶、纤维素等)含量和相关酶类活性及相关基因的表达变化，以期为枣果实发育与成熟评价提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料的预处理

2016年9-10月在西北农林科技大学清涧红枣试验站(37°07′N，110°04′E)，选择10 a生健康骏枣树，从东南西北4个方向随机采集二次枝上的健康果实，分7个时期采摘，即白熟期、脆熟期3个时期(初红期、半红期、全红期)和完熟期3个时期(完熟前期、完熟中期、完熟后期)。果实去皮并将果肉切成小块，迅速装入50 mL离心管中，在液氮环境下带回实验室，于-80 ℃冰箱中保存，作为实时荧光定量PCR测定基因表达量的样品。用于枣果生理指标、细胞壁物质含量和酶活性测定的果实装在塑封袋中低温(4 ℃)带回，洗净，一部分果实用于硬度等生理指标测定；另一部分去皮后取果肉组织，切成小块，迅速装入用液氮预冷的50 mL离心管中，于-80 ℃冰箱中保存备用。所有样品设3个重复。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 果实硬度、含水量、可溶性固形物含量和色差的测定 (1)硬度。在果实中部赤道线上均匀选3个点，再在果实两端各选1个点，共5个点，削去5个点处的外果皮，用手持硬度计(FHT-15，广州兰泰仪器有限公司)测10个果实的硬度。

(2)含水量。用烘干称重法，称取约1 g样品于称量瓶中，称总质量后，放入预先升温至105 ℃的烘箱中杀青10 min，再于70 ℃恒温烘至恒质量(约5 h)，放入干燥器中冷却后称质量，计算含水量(%)，设3个重复。

(3)可溶性固形物(TSS)含量。用数显糖度计(CNT65，杭州陆恒生物科技有限公司)测定，每个重复读数3次，测10个果实。

(4)色差。以色彩色差仪(CR-400，DP-400，柯尼卡美能达有限公司)测定，随机选择果面5个点，重复测量L*、a*、b*值，其分别表示色泽的明-暗、红-绿和黄-蓝变化，测10个果实。

1.2.2 果胶、纤维素含量和酶活性测定 (1)果胶。参考曹建康等[15]的咔唑比色法测定，略有改动。以各浓度梯度的半乳糖醛酸标准液制作标准曲线，在紫外分光光度计(UV-2550，岛津，日本)下选择光度测定模块，测定样品在530 nm波长下的吸光值，重复3次。果胶含量以质量分数表示。

(2)纤维素。参考曹建康等[15]的蒽酮-硫酸法测定，略有改动。以各浓度梯度的纤维素标准液制作标准曲线，在620 nm波长下测定样品的吸光值，重复3次。纤维素含量结合果实含水量来计算，以“mg/g”表示。

(3)多聚半乳糖醛酸酶(PG)。参考曹建康等[15]的比色法测定，略有改动。各浓度梯度的葡萄糖溶液加入DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸)制作标准曲线，在540 nm波长下测定吸光值，重复3次。PG活性以每小时每克样品催化多聚半乳糖醛酸水解形成半乳糖醛酸的质量表示(mg/(h·g))。计算时将葡萄糖换算成半乳糖醛酸的系数为1.08(194/180)。

(4)果胶酯酶(PE)。参考程杰山[16]的连续分光光度计法测定，略有改动。反应体系包含2 mL体积分数0.5%、pH 7.5的果胶溶液，0.15 mL体积分数0.01%、pH 7.5的溴百里香酚兰溶液，加pH 7.5的蒸馏水至3 mL，最后加入100 μL酶液，在620 nm处测定吸光值，记录1 min内的OD值变化，重复3次。PE酶活性以“ΔOD620/(min·g)”表示。

(5)纤维素酶(Cx)。参考曹建康等[15]的DNS还原法测定，略有改动。标准曲线制作和酶液制备方法同PG活性测定。以10 g/L羧甲基纤维素钠(CMC)溶液为反应底物，分别加入新鲜酶液和失活酶液，之后步骤同PG活性测定，重复3次。Cx活性以“mg/(h·g)”表示。

1.3 枣果实成熟相关基因的表达量分析

用RNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，宝生物工程有限公司)提取各时期果实样品总RNA，再用50 μL纯化体系纯化后，检测RNA浓度和纯度。用RNA反转录试剂盒(TaKaRa Prime ScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser，含qRT-PCR步骤)SYBR Green分析法反转录合成cDNA，反应步骤参照试剂盒说明书，使终质量浓度为200 ng/μL。

以枣UBQ基因(登录号为EU916200.1)为内参基因[17]。根据骏枣转录组测序结果[14]，筛选30个与果实成熟软化过程中细胞壁代谢相关的基因，在生工生物公司设计并合成特异性引物。以TaKaRa实时荧光定量PCR反应试剂盒SYBR GreenⅠ扩增，以验证引物序列的正确性，最终选定15对引物进行qRT-PCR反应。表1为内参基因和目的基因的引物序列和扩增信息。

表1 内参基因与15个目的基因的引物序列、扩增效率和相关系数Table 1 Primer sequences and amplification information of reference and target genes

表1(续) Continued Table 1

注：UBQ.内参基因；PG-1NCC.多聚半乳糖醛酸酶-1-非催化亚基；PG-QRT3.多聚半乳糖醛酸酶-QRT3；PE.果胶酯酶基因；PE-2PR.果胶酯酶-2前体；exo-PG.外切多聚半乳糖醛酸酶基因；CelS-CS.纤维素合酶A催化亚基；EGase.内切1,4-β-葡萄糖苷酶基因；β-Glu40.β-葡萄糖苷酶40；GEGlu7.葡聚糖-内切-1,3-β-葡萄糖苷酶7；EnGase25.内切葡聚糖酶25；XTH6.木葡聚糖内糖基转移酶6；Gal17-1.β-半乳糖苷酶17-1。表3、5、6同。

Note:UBQ.Reference gene;PG-1NCC.Plygalacturonase-1 non-catalytic subunit;PG-QTR3.Polygalacturonase-QRT3;PE.Pectinesterase gene;PE-2PR.Pectinesterase-2 precursor;exo-PG.Exo-Plygalacturonase gene;CelS-CS.Cellulose synthase A catalytic subunit;EGase.Endo-1,4-β-glucanase gene;β-Glu40.β-Glucosidase 40;GEGlu7.Glucan endo-1,3-β-glucosidase 7;EnGase25.Endoglucanase 25;XTH6.Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases 6;Gal17-1.β-Galactosidase 17-1.The same for Table 3，Table 5 and Table 6.

在荧光定量PCR仪上(Bio-Rad CFX9)对选定的引物进行qRT-PCR反应。反应体系10 μL，其中包含5.0 μL SYBR®Premix Ex Taq Ⅱ，0.4 μL上游引物，0.4 μL下游引物，1 μL cDNA和3.2 μL dH2O。PCR反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39个循环；95 ℃ 10 s，65 ℃ 5 s。每个样品3个重复。根据F=2-ΔΔCT计算基因相对表达量。

1.4 数据处理

用SPSS 19.0对试验数据进行统计和Duncan’s多重比较，用Excel 2010和SigmaPlot 12.5绘图。

2 结果与分析

2.1 骏枣成熟过程中果实生理指标的变化

骏枣果实成熟和软化过程中外观形态、硬度、含水量、TSS含量及色泽的变化如图1和图2 所示。

WM.白熟期；TR.初红期；HR.半红期；FR.全红期；ER.完熟前期；MR.完熟中期；LR.完熟后期。下图同 WM.White mature;TR.Turning-red;HR.Half red;FR.Full red;ER.Early ripe;MR.Middle ripe;LR.Late ripe.The same below图1 骏枣果实各发育时期外观形态的变化Fig.1 Morphological change of ‘Junzao’ fruit during developmental stages

骏枣果实成熟经历白熟、脆熟和完熟期，果实逐渐着色，于完熟期开始软化，失水皱缩；骏枣白熟期果实硬度最大，完熟后期硬度显著减小。果实含水量从白熟期到完熟前期逐渐下降，完熟中期有所增加，完熟3个时期平均含水量为63.15%。果实TSS含量从白熟期到完熟前期呈线性增加趋势，由14.89%增至28.26%，体现了果实中可溶性糖、酸等营养物质的积累。果实从白熟期至全红期L*显著减小，表明果实表面由明变暗；a*显著增大，表明果实由绿变红；b*逐渐减小，表明果实由黄变蓝。完熟3个时期内L*、a*和b*数值呈稳定状态，表明果实完全着色后色泽几乎无变化。

标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下图同Lower case letters indicate significant difference(P<0.05).The same below

2.2 骏枣果实成熟过程中细胞壁相关生理指标的变化

骏枣果实成熟过程中果胶、纤维素含量变化如图3所示。由图3可见，果胶含量、原果胶(PP)和可溶性果胶(SP)含量均无显著变化，完熟期纤维素含量显著高于脆熟期。

3种细胞壁物质相关酶类的活性变化如表2所示，随着骏枣果实成熟，PG活性呈波动状态但变化不显著，表明在骏枣果实软化关键期(由全红期转至完熟期)PG并未起到关键作用；PE活性在完熟期有所增加但不显著；Cx活性变化与PE相似，特别是在完熟前期活性升高。

图3 骏枣果实各发育时期果胶和纤维素含量的变化Fig.3 Changes of pectin content and cellulose content in ‘Junzao’ fruit during developmental stages

发育时期 Developmental stage PG活性/(mg·h-1·g-1)PG activityPE活性/(ΔOD620·min-1·g-1)PE activityCx活性/(mg·h-1·g-1)Cx activity白熟期 White mature1.03±0.01 a0.09±0.03 a0.24±0.12 a初红期 Turning-red0.37±0.12 b0.09±0.02 a0.14±0.05 a半红期 Half red0.80±0.55 ab0.09±0.03 a0.17±0.08 a全红期 Full red0.68±0.32 ab0.08±0.01 a0.15±0.03 a完熟前期 Early ripe0.49±0.07 ab0.12±0.02 a0.34±0.09 a完熟中期 Middle ripe0.71±0.14 ab0.11±0.02 a0.26±0.16 a完熟后期 Late ripe0.43±0.18 b0.12±0.01 a0.33±0.14 a

2.3 骏枣果实成熟过程中果实软化相关基因表达量的变化

由图4可知，PG基因家族3个基因的表达量变化趋势基本一致，从白熟期开始表达量呈下降趋势，到完熟期时表达量接近0，白熟期到全红期的表达与转录组结果[14]一致。PE基因家族3个基因表达均呈“先升后降”的变化趋势，PE-3在初红期表达量最高，PE1和PE-2PR均在半红期表达量最高，3个基因在完熟期表达量已显著降至低水平，PE-2PR在白熟期和脆熟期的表达趋势与转录组结果[14]一致。

图4 骏枣果实各发育时期PG和PE基因的相对表达量Fig.4 Relative expression levels of genes involving in polygalacturonases and pectinesterases at seven developmental stages in ‘Junzao’ fruit

与纤维素酶相关的基因在骏枣果实成熟期的表达量如表3所示。CelS-CS3和CelS-CS9在脆熟期较稳定，完熟期后表达量下降到低水平，表明骏枣纤维素合成调控主要在脆熟期，完熟期被抑制。EGase1与EGase2的表达量呈“先升后降”趋势，分别在半红期和全红期达到最大，完熟后期表达量最低，EGase1在前4个时期的表达量与转录结果[14]一致。此外，GEGlu7和EnGase25的表达量变化趋势同样与转录结果[14]一致，且前4个时期表达量显著高于完熟3个时期。而β-Glu40从初红期到半红期表达量急剧增加，之后缓慢下降，但直至完熟后期仍高于初红期。

表3 骏枣果实各发育时期纤维素合成酶和纤维素酶基因的相对表达量Table 3 Relative expression levels of genes involving in cellulose synthases and cellulases at seven developmental stages in ‘Junzao’ fruit

与枣果实细胞壁代谢相关的2个基因XTH6和Gal17-1的表达情况如图5所示。图5显示，二者表达量均呈“先升后降”的趋势，分别在半红期和全红期达到最高水平；XTH6表达量在半红期后显著下降，Gal17-1表达量在全红期后显著下降至较低水平。

图5 骏枣果实各发育时期XTH6和Gal17-1基因的相对表达量Fig.5 Relative expression levels of genes involving in XTH6 and Gal17-1 at seven developmental stages in ‘Junzao’ fruit

2.4 骏枣果实成熟生理指标与基因表达量的相关性分析

骏枣果实成熟生理指标与基因表达量的相关性如表4-6所示。由表4可知，骏枣果实成熟和软化过程中硬度与含水量无显著相关性，TSS含量与含水量呈显著负相关。果胶含量与纤维素含量呈显著正相关，与硬度、含水量呈显著负相关；纤维素含量与含水量呈极显著负相关。3种酶中，PG活性与果胶和纤维素含量无显著相关性，PE、Cx活性与果胶和纤维素含量总体呈显著正相关。

由表5可知，3个PG基因表达量与果胶含量和PG活性间相关性总体较小，只有PG-1NCC与PG活性呈显著正相关，exo-PG与果胶含量呈显著负相关。3个PE基因与果胶含量和PE活性均呈显著负相关，其中PE1和PE-2PR表达量与PE活性呈极显著负相关；此外，Gal17-1表达量与果胶含量呈显著负相关。

由表6可知，CelS-CS3、CelS-CS9、GEGlu7、EnGase25与纤维素含量呈极显著负相关，Glu40与纤维素含量、Cx活性无显著相关性，XTH6表达量与纤维素含量无显著相关性。

表4 骏枣果实成熟过程中细胞壁代谢生理指标间的相关性Table 4 Correlation of physiological indexes during fruit developmental stages in ‘Junzao’

注：*.在P<0.05 水平(双侧)上显著相关；**.在P<0.01 水平(双侧)上显著相关。下表同。

Note:*.Significant linear correlation ofP<0.05;**.Significant linear correlation ofP<0.01.The same below.

表5 骏枣果实成熟过程中果胶含量、果胶酶活性与其基因表达量的相关性Table 5 Correlation of pectin content with pectinesterases activity and related gene expression during fruit developmental stages in ‘Junzao’

表6 骏枣果实成熟过程中纤维素含量、纤维素酶活性与其基因表达量的相关性Table 6 Correlation of cellulose content with cellulase activity and related gene expression during fruit developmental stages in ‘Junzao’

3 讨 论

本研究发现，从白熟期到脆熟期，骏枣果实硬度无显著变化，完熟期果实变软，硬度和含水量减小。随着果实成熟，骏枣可溶性固形物含量逐渐增加，表明糖、酸等营养物质逐渐积累。从白熟到脆熟期，骏枣果实果皮由绿白色变为红色，完全着色后果皮颜色无显著变化，果肉由绿白色变为褐色，这与金丝小枣的颜色变化[18]基本一致。随着骏枣果实的成熟，其果胶含量无显著变化，纤维素含量到完熟期时显著增加，这与果实成熟软化过程中细胞壁纤维素微纤丝结构崩解但相对含量未发生变化有关[5]；同时，完熟期果实软化失水也是造成细胞壁干物质含量不减反增的重要原因。骏枣果实成熟过程中可溶性果胶、纤维素含量变化与甜橙一致，甜橙成熟期膳食纤维主要由纤维素和可溶性果胶构成[19]。

本研究发现，PG活性在骏枣成熟过程中呈波动状态，与果实硬度、含水量相关性不强。其3个调控基因(PG-1NCC、PG-QRT3和exo-PG)随着果实发育成熟，表达量逐渐降至较低水平，与果胶含量、PG活性的相关性较弱，未在果实完熟期的软化过程中发挥调控作用。PG在许多水果中被认为是引起果实软化的关键因子[20-22]，也有研究认为，PG并非果实软化的关键因素，且不能独立引起果实软化[23]。有研究表明，PG基因结构的变异是造成其功能差异的主要原因[24]。

本研究发现，PE活性在骏枣成熟过程中有所增加，与果实含水量、果胶和纤维素含量变化显著相关，参与果实成熟和软化；3个PE基因(PE-3、PE1和PE-2PR)在脆熟期表达量最高，完熟期则降低，表明PE基因对骏枣果实软化有先导作用。这与PE在冬枣等品种软化中的作用[25]一致。PE活性在番茄、桃等果实成熟期也有所增加[26-27]，与本研究结果一致。

Cx酶是由多种纤维素酶类组成的混合酶。本研究发现，骏枣成熟过程中纤维素含量与Cx活性呈显著相关。2个纤维素合成酶基因CelS-CS3和CelS-CS9在白熟期和脆熟期大量表达，与纤维素含量变化呈极显著负相关。GEGlu7和EnGase25也在白熟期和脆熟期大量表达，表明其对纤维素酶的调控集中在白熟期和脆熟期。2个内切葡萄糖苷酶基因EGase1、EGase2在脆熟期表达量最高，表明它们对纤维素酶的调控集中在脆熟期，这与番茄中LeCel7和LeCel2 mRNA的表达[28-29]相似。骏枣中β-葡萄糖苷酶基因β-Glu40也在脆熟期表达量最高，且在完熟期3个时期的表达量相比其他基因较高，表明其对纤维素酶的调控持续至完熟后期，对骏枣完熟期的软化具有重要作用。本研究中，XTH6和Gal17-1对骏枣果实调控的关键时期在脆熟期；有研究表明，梨枣和沾化冬枣中ZjXTH1和ZjXTH2在果实转红期的调控作用显著[12]，这些枣果实中XTH基因的表达与苹果和猕猴桃果实成熟软化过程中一些XTH基因的表达趋势[30-31]较一致。

4 结 论

骏枣从完熟期开始成熟和软化，果实硬度和含水量下降，果胶和纤维素含量、PE和Cx活性都在完熟期有所增加。3个PG相关基因表达量逐渐降低，且在完熟期降到最低水平；3个PE相关基因在脆熟期的表达量最高，在完熟期也降到最低水平；在7个纤维素及其酶类的相关基因中，β-Glu40在完熟期有较高表达量。上述结果说明，PG及相关基因并非骏枣果实成熟和软化的关键因子，PE相关基因对果实软化具有先导作用，纤维素及其酶类相关基因联合调控果实成熟过程，β-Glu40对果实成熟后期的软化具有重要作用。这些生理指标的变化和相关基因的表达模式及调控功能，对于研究枣果实成熟的细胞壁代谢具有重要意义。