鼠疫免疫学检测技术的应用和研究进展

王蒴 王信惠 黎唯

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis，鼠疫菌）引起的一种自然疫源性疾病，啮齿动物为主要宿主和传染源，蚤类是主要传播媒介。在发生人间鼠疫时，鼠疫患者可间接转变为传染源，尤以肺鼠疫患者传染性最强，通过飞沫可造成大范围人间鼠疫的流行。鼠疫病程短、传染性强、传播速度快、致死率高，在我国被列为甲类传染病。

鼠疫“四步检验”方法在鼠疫检菌中发挥着重要作用，分离出鼠疫菌是判定鼠疫疫情、新鼠疫疫源地和临床诊断鼠疫病例的重要依据，但该法耗时费力，分离到鼠疫菌至少需要3 d 时间，腐败标本、时间过久标本或鼠疫患者服用抗生素等情况下，均影响鼠疫菌的检出，尤其在人间鼠疫疫情处理过程中寻找潜在鼠疫患者显然时间过长，从而易造成鼠疫疫情的扩散和蔓延，错过最佳治疗时间。因此，寻找快速、简便、特异的免疫学检测技术用于鼠疫疫情控制十分必要。间接血凝试验（IHA）最早应用于鼠疫领域，在鼠疫防控和科学研究中发挥了重要作用，随着新材料和检测技术的进步，陆续出现了酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫沉淀试验（RIPA）、鼠疫F1McAb 酶免疫染色技术（EIT）、胶体金免疫层析技术（GICA）等免疫学检测新技术，并逐步应用于鼠疫监测和人间鼠疫疫情处置工作中，现就鼠疫免疫学检测技术的应用和研究进展做一综述。

1 免疫学检测技术

免疫学检测技术的原理是通过抗原和抗体特异性反应结合实现的，F1 抗原是鼠疫菌特有的荚膜抗原，是菌体表面主要的免疫活性物质，能够刺激感染性机体产生抗体并引起主要的抗体反应。抗原与相应抗体在体外一定条件下发生特异性结合，形成抗原-抗体复合物，鼠疫免疫学检测技术通常用已知的F1抗原/抗体检测未知的F1 抗体/抗原。

2 间接血凝试验

IHA 是世界卫生组织（WHO）推荐的鼠疫血清学常规诊断方法，是目前我国应用最广泛的鼠疫免疫学检测方法之一。IHA 原理是将已知的鼠疫F1 抗原/抗体吸附于致敏的绵羊红细胞上，携带F1 抗原/抗体的红细胞在一定反应条件下与标本中相应的抗体/抗原产生特异性结合，通过沉淀呈现凝集相用以观测实验结果。IHA 包括：正相间接血凝试验（IHA），用于检测血清中的鼠疫F1抗体；反相间接血凝试验（RIHA），用于检测动物脏器或骨髓等标本中的鼠疫F1 抗原；该检测方法在既往的鼠疫防控工作中发挥了十分重要的作用。IHA 通过初筛试验和复判试验两步完成，初筛试验用于选择出阳性标本，复判试验则为了排除假阳性。IHA 有2 种方法，分别为试管法和微量法，2 种方法的阳性率差异无统计学意义。Meyer 研究发现，IHA 检出阳性率高于细菌学，但IHA检出阳性率低于ELISA 和GICA等方法，王成祥等分别用IHA、ELISA 检测3260 份动物血清样本，用RIHA、ELISA、GICA 检测322份自毙动物材料，结果显示，IHA阳性检出率低于ELISA，RIHA 阳性检出率低于ELISA 和GICA。

IHA 主要用于鼠疫自然疫源地调查、疫源地监测、疑似鼠疫患者的诊断和追溯诊断。根据血凝阳性率和滴度可以预测该地区动物间鼠疫流行强度及趋势。在未分离到鼠疫菌的情况下，IHA 具有重要的诊断意义。IHA 具有敏感性高、特异性强、快速、易操作等优点，但存在操作繁琐、结果稳定性差；温度、酸碱度、嗜异性凝集素等造成非特异凝集等不足。RIHA 主要用于新鲜（腐败）脏器标本、干枯动物骨骼标本中鼠疫F1 抗原的检测，甚至在腐败1年后的材料中仍可获得阳性结果，对判定当地鼠疫流行和追溯疫源有一定意义。RIHA 方法具有特异、快速的特点。但用该方法判定结果最短需2 h，还需有一定的技术要求，容易出现非特异性凝集。

3 酶联免疫吸附试验

ELISA 是一种灵敏、特异、快速、简便的检测方法，20 世纪70年代后在医学领域得到广泛应用。ELISA 检测原理是将鼠疫F1 抗原/抗体包被于酶标反应板上，通过抗原/抗体反应将标本中的鼠疫F1 抗体/抗原结合在反应板上，经酶标记的抗原/抗体进行再次结合，通过酶催化底物产生颜色酶标仪机读或肉眼观测达到检测目的。1979年Cavanaugh 等首次将ELISA 应用于人和啮齿动物的鼠疫诊断中。在人类鼠疫诊断中，将酶标记在抗IgG 抗体上，若有抗F1 的IgG 结合在酶标板上，则这种标记抗体就结合上去显示阳性反应；而在动物鼠疫监测中，是将酶标记在提纯的F1 抗原上，这样就使ELISA 成为适用于不同动物但仅可检测鼠疫的方法。国内外很多学者对ELISA 进行改良，使其应用范围更广。Splettstoesser 等用F1 抗原ELISA 捕获法检测鼠疫患者血液、尿液和淋巴腺液中的F1 抗原，结果显示，ELISA 法的敏感性和特异性均高于RIHA，该法最低检测浓度可达到4 ng/mL。热娜·吐尔地等用夹心法ELISA 检测动物血清鼠疫F1抗体，同时用IHA 法进行比对，ELISA 检测长尾黄鼠（Spermophilus undulatus）、 犬（Canis lupus familiaris）血清鼠疫F1 抗体的阳性率和平均滴度均高于IHA，差异非常显著。王信惠等建立ELISA 捕获法检测犬和猫（Felinae）鼠疫抗体IgM 方法，并观测犬和猫感染鼠疫菌后鼠疫抗体IgM 的消长动态，犬和猫鼠疫抗体IgM 高峰期分别为5～23 和7～10 d，犬和猫鼠疫抗体IgM 分别在第46 天和第30 天后降至阳性标准以下，通过检测犬和猫鼠疫抗体IgM 对及时掌握北方旱獭（Marmota bobak）和南方家鼠鼠疫自然疫源地动物间鼠疫近期流行状态有积极意义。目前在我国鼠疫监测中，已广泛使用ELISA（夹心法）检测各种不同血清中的鼠疫F1 抗体和脏器或骨髓中的F1 抗原。常娅莉等研制的鼠疫菌ELISA 诊断试剂盒经杜春红等应用效果评价，其特异性、稳定性和敏感性均高于IHA 和RIHA，现已批量生产，在鼠疫防治和科研工作中具有广泛的应用前景。

4 放射免疫沉淀试验

RIPA 于20 世纪70年代引入到鼠疫F1 抗体的检测中，20 世纪80年代初我国学者建立的RIPA应用于全国大部分地区的鼠疫监测工作中，并证实RIPA 是一种敏感性高、特异性强的检测方法。RIPA 是用放射性核素标记鼠疫特异性抗原，当被检血清中含有鼠疫特异性抗体时，抗原抗体反应形成抗原抗体复合物，根据抗原抗体复合物的放射性含量，即可检测出血清中特异性抗体的含量。

RIPA 具有特异性高、敏感性强、检出率高等优点。杨智明等用RIPA对云南省2956份人血清进行鼠疫F1抗体检测，结果显示，RIPA 的阳性检出率和阳性抗体几何平均滴度均高于IHA，且IHA 阳性者RIPA 无一阴性。赵志海和王迈用标记的鼠疫菌F1 抗原（125I-F1）与抗假结核菌等10 种菌的21 份血清进行交叉实验，均未出现交叉反应。用IHA 检测感染鼠疫56 个月的黄鼠血清呈阴性，12 个月后用RIPA 法仍能检测到抗体，说明RIPA能检出不完全抗体，从而提高了检出率。此外，RIPA 适用于静息期内的疫源探索，对发现新鼠疫疫源地，鉴定疫源地的活动状态也具有重要意义。云南省野鼠鼠疫疫源地于1974年被发现，自1985年有学者用RIPA 对该省疫源地的动物血清进行流行病学调查，结果除在疫源地的5 个县检出阳性血清外，还在其外围的2 个县检出了阳性血清，不仅验证了疫源地的分布，还发现了新的疫源地。虽然RIPA具有较高的敏感性和特异性，但同时具有放射性同位素，对操作者存在潜在危害，现已几乎不再使用。

5 胶体金免疫层析技术

GICA 是一种特异、敏感、快速、易操作的检测方法。该方法兴起于20 世纪80年代，是一种新的免疫学检测方法，在生物、医学等领域得到了广泛应用。Chanteau 等最先将GICA 引入到鼠疫早期诊断和检测应用中。鼠疫F1 抗原GICA 法的原理是将鼠疫F1 单克隆抗体、鼠疫F1抗原分别固定于硝酸纤维素膜作为检测带和质控带，胶体金标记鼠疫F1 单克隆抗体固相后放置于加样孔和检测带之间，应用膜层析双抗原夹心法检测样本中的鼠疫F1 抗原。该方法按照金颗粒标记对象不同（F1 抗原或F1 抗体），可以检测不同对象（F1 抗体或F1 抗原）。近年来鼠疫抗原/抗体胶体金技术逐渐成熟，并广泛应用于鼠疫的快速诊断和监测中。王鹏等建立的检测鼠疫F1 抗原/抗体胶体金试纸条，可在15 min 内检出粗制F1 抗原浓度为0.5 ng/mL，最小检出EV 菌菌量为10 万菌体/mL，特异性达到100%，与44 株鼠疫近缘菌无交叉反应。2006年为评价该胶体金试纸条在现场应用中的效果，采用GICA、IHA及ELISA 分别对新疆维吾尔自治区（新疆）1304 份和内蒙古自治区（内蒙古）100 份血清进行检测，新疆血清检测中，GICA、IHA 和ELISA3种方法符合率高度一致，GICA 敏感度高于IHA 及ELISA；内蒙古血清检测中，GICA 与IHA 的检测结果完全一致。采用RGICA、RIHA 和F1- ELISA 分别对新疆224 份和内蒙古100 份鼠类脏器标本进行检测，新疆鼠类脏器检测结果显示，RGICA、RIHA 和F1-ELISA3 种方法和检菌结果符合率高度一致，RGICA 的敏感性高于RIHA 及F1-ELISA；对内蒙古鼠类脏器检测中，RGICA 和RIHA 与检菌结果完全一致，且RGICA 比RIHA 的敏感性高13%。证实该胶体金免疫层析试纸条具有较好的敏感性与特异性。

GICA 法实验结果肉眼可测，不需要任何仪器，尤其适合野外和突发疫情的情况下使用。但GICA 法易造成漏检，试剂的灵敏度也会限制GICA 法的灵敏度，胶体金试剂的 灵敏度为10 ng/mL，当检测量低于10 ng/mL 时，即容易出现假阴性。该法只能用于初筛检测，不能作为确诊依据，需与IHA 或ELISA 法结合应用，结果更为可靠。

6 鼠疫F1McAb 酶免疫染色技术

EIT 也称酶免疫组织化学技术，是指在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或者细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，形成带酶分子的复合物，酶催化底物产生有色的不溶性产物，使组织或细胞被染色，通过显微镜可识别标本中抗原（抗体）的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的 目的。随着鼠疫F1 单克隆抗体的出现，相关学者将鼠疫F1McAb 与酶免疫染色技术相结合，建立了鼠疫F1McAb 酶免疫染色法：将待检标本进行固定后，加入辣根过氧化物酶标记的鼠疫F1 单克隆抗体，最后加底物进行显色。鼠疫F1 单克隆抗体的特异性和酶免疫染色鼠疫菌的敏感性相结合技术，提高了检测的准确性，在检测实验室感染鼠疫菌小鼠脏器标本F1 抗原中得到很好的应用，HRP-F1McAb 酶免疫染色技术检测阳性率为98%，与细菌学、RIHA和ELISA3 种方法阳性检出率差异无统计学意义，具有较好的敏感性和特异性。白雪薇等用EIT 法对细菌标本进行鼠疫菌检测，细菌标本酶免疫染色法检测结果与实际相符，酶免疫染色技术检测鼠疫菌的灵敏性为1000 ng/mL。EIT 法对仪器要求不高，显色后在普通显微镜下可观察结果，1 h 完成实验，且标本可长期保存，是一种简便、特异、省时的检测方法，适用于鼠疫早期快速诊断与疫情监测工作。

7 结语

IHA 在我国应用可追溯到70年代，至今已40 余年，曾在鼠疫研究和鼠疫追溯诊断方面发挥着重要作用，至今仍在应用。IHA 属于液相反应，溶液pH 值、温度、离子强度以及标本腐败程度均影响反应结果，滴度高的标本存在前滞反应易漏诊，且不同批次的试剂存在一定差异，稳定性难以保证。RIPA 虽然敏感，但阳性标本和假阳性标本的敏感性均提高，特异性也难保证且对人体存在放射性危害，现已基本不太使用。ELISA 属于固相反应，受标本腐败程度影响较小，在酶标板洗涤过程中可将未结合的抗 原或抗体以及标本杂质洗涤清除，从而保证了结果的特异性和稳定性。EIT 是目前镜检鉴定鼠疫菌最快的方法，常温1 h 出结果，鼠疫F1McAb 保证了结果的特异性，该法快速、特异、简便，适用于鼠疫疫情的处理。

鼠疫免疫学检测方法的敏感性、特异性和稳定性取决于鼠疫F1抗原和抗体纯度，目前鼠疫免疫学检测中所用的F1 抗原仍是粗提的，纯度较低。重组F1 抗原易提取、纯度高且具有良好的免疫活性，用重组F1 抗原代替天然F1 抗原已十分必要。鼠疫F1McAb 的推广和应用保证了免疫学检测技术的敏感性和特异性。近年来，GICA 在鼠疫野外监测及快速诊断中得到较好地推广应用，GICA 操作简单，无需仪器，具有较高特异性和敏感性，15～30 min即可判定结果，但该法只能定性不能定量，需与ELISA 或IHA 等其他方法联合应用。每一种鼠疫免疫学检测方法都有其优缺点，在条件允许的情况下，应多种方法同时应用，可以有效解决非特异性、假阳性等问题，达到有效、快速、准确地判定鼠疫疫情的目的，从而阻止鼠疫疫情的进一步传播和扩散。■