以金属有机框架材料为基质免疫磁珠的制备及在玉米样品检测中应用

孙毅蒙 丁 轲 韩 涛 陈湘宁

(北京农学院食品科学与工程学院1，北京 102206 )(食品质量与安全北京实验室2，北京 102206)(农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室3，北京 102206)

金属-有机框架(Metal-Organic Frameworks)，简称MOFs，是由有机配体和金属离子或团簇通过配位键自组装形成的具有分子内孔隙的有机-无机杂化材料[1-3]。该类材料将无机金属节点与有机框架通过配位键结合在一起，形成了多种多样的结构，并由此导致其具有丰富的性质，从而在诸多领域都有良好的应用前景[3-4]。应用于样品前处理的金属有机框架材料主要有IRMOF类、MIL类、UiO类、ZIF类和金属有机框架复合材料等，它们都具有多孔的结构，对目标物有良好吸附性，多被用来作为固相萃取的填料[5-7]。Liang等[8-9]通过对小分子配体核苷酸和金属离子间的反应研究，合成了超分子网状结构金属-有机凝胶。它是由AMP和Zn2+通过配位键自组装的方式形成的，具有多孔结构，性能稳定，可以固定抗体。该材料在制备及偶联抗体的过程中，无需特殊反应条件和试剂，制备简单[5]。我们将其作为一种免疫基材与当前热门的研究-纳米磁珠技术[10-11]结合起来，制备出了一种新型的以AMP&ZnCl2水凝胶为基质的免疫磁珠[13-15]。

真菌毒素种类繁多，毒性大，有致癌、致畸、致突变作用，严重威胁人类的健康[16-18]。真菌毒素样品前处理方法主要有固相(微) 萃取、液相(微) 萃取、免疫亲和层析、磁分离技术等，这些前处理方式虽然都能实现对目标物的分离，但是相应的还有一定的缺点。如固相萃取法一般采用固相萃取柱进样填料装柱麻烦，选择性也差；液相萃取的缺点是稳定性差，不能重复使用；免疫亲和层析法虽然选择性强，但是成本高、机械强度差；磁分离技术的选择性差，需要用免疫材料辅助来提高其灵敏度[19]。

本研究就是基于磁分离技术操作简单、机械强度大、稳定性好的优点[20]，选择了一种制备起来较为简单的免疫基材-AMP&ZnCl2·ZEA单抗，制备成免疫磁珠应用到粮谷制品中玉米赤霉烯酮毒素的前处理[21-22]。这种新型的以金属有机框架材料为基质的免疫磁珠的制备为今后免疫磁珠的深入研究拓宽了思路，其在真菌毒素检测中的应用拟为解决食品中真菌毒素的纯化问题提供方法借鉴，也为新型的真菌毒素检测材料的研究和开发提供了新的方向。

1 材料与方法

1.1 实验材料

ZEA单抗:北京点石科创科技有限公司和本课题组合作研发制备；甲醇、乙腈(色谱纯):美国Fisher公司；七水合硫酸亚铁、氢氧化钾、硝酸钾、体积分数为25% 戊二醛溶液、司班80、石蜡溶液、氯化锌(分析纯):汕头市西陇化工厂有限公司；一磷酸腺苷二钠盐(色谱纯):SIGMA公司；10 mmol/L pH 7.4 HEPES溶液:北京欣华绿源科技有限公司；0.01 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液:HyClone公司；玉米粉:回龙观城北市场；DZTMS-PREP免疫亲和柱:德国 R-Biopharm。

1.2 仪器与设备

1200高效液相色谱-6410三重四级杆质谱联用仪:美国安捷伦公司；DSHZ-300A 水浴恒温振荡器:苏州培英实验设备有限公司；Nicolet iS10傅里叶红外光谱仪:美国赛默飞世尓科技分子光谱；S-4300场发射扫描电子显微镜:日本日立/Hitachi高新技术公司；HL-2恒流泵:上海沪西分析仪器厂有限公司；JJ-1精密增力电动搅拌器:常州国华电器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的制备1.3.1.1 Fe3O4磁核的制备[10]

称取20.0 g七水合硫酸亚铁溶解于140.0 mL去离子水中，水浴加热到90 ℃并在转速400 r/min的机械搅拌条件下反应1 h。同时另取1.6 g硝酸钾和11.2 g氢氧化钾溶解于60.0 mL去离子水中，配制好的溶液用恒流泵逐滴(1 mL/min)加入至亚铁离子溶液中。添加完毕继续在90 ℃下搅拌2 h，得黑色浑浊溶液，用去离子水洗涤数次并烘干，黑色固体即为四氧化三铁。

1.3.1.2 AMP&ZnCl2水凝胶包覆磁珠[13]

称取0.196 g 一磷酸腺苷二钠盐溶解于20 mL HEPES buffer(10 mmol/L，pH7.4)中，再加入200 mg 四氧化三铁，充分搅拌。将150 mL含7%司班80的石蜡混合液在搅拌状态下逐滴加入其中，经500r/min搅拌形成乳化体系，持续搅拌30 min水浴加热至40 ℃，然后加3 mL戊二醛溶液(C5H8O2，体积分数25%)，恒温交联反应30 min。降低温度，在常温条件下将2 mL 1 mg/mL ZEA单抗用恒流泵逐滴(1 mL/min)加入反应体系中，搅拌均匀后再用恒流泵逐滴(1 mL/min)加入10 mL 50 mmol/L的ZnCl2溶液，常温交联反应2 h。

反应结束后，依次用石油醚、乙醇、去离子水洗涤数次，用磁铁分离出固体物即获得包覆了水凝胶并偶联了ZEA单抗的磁性微球，将其封存于HEPES buffer(10 mmol/L，pH 7.4)中。

1.3.2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的鉴定与评价

1.3.2.1 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的表征

用场发射高分辨扫描电子显微镜观察Fe3O4微球和Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠形态；红外光谱仪测定Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠表面官能团性质：称取样品1～2 mg，加入200 mg溴化钾粉末研磨，压片法测定其红外光谱。

1.3.2.2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的负载量及重复性使用效果

取100 mg Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠于10 mL离心管中，先用超纯水洗涤两遍，用磁铁收集磁珠除去水洗液。加入3 mL 1.2 μg/mL的ZEN毒素标准溶液，混合均匀，在摇床上振荡反应30 min。反应结束后，用磁铁收集磁珠，取出上清液用孔径为0.22 μm的有机相微滤膜过滤后，测定其中的ZEA浓度。根据上清液体积，计算上清液中ZEA质量。用3 mL超纯水洗涤两次磁珠，用磁铁收集磁珠，合并两次水洗液用孔径为0.22 μm的有机相微滤膜过滤洗涤液，测定其中的ZEA浓度，由水洗液体积，计算水洗液中ZEA质量。用3 mL甲醇(3 mL/次)洗涤磁珠三次，每次加入甲醇后振摇10 min，洗脱磁珠上吸附的ZEA毒素，用磁铁收集磁珠，取出甲醇洗脱液用孔径为0.22 μm的有机相微滤膜过滤后，三次洗脱液不合并，分别测定甲醇洗脱液中ZEA浓度，根据每次的醇洗液体积，计算醇洗液中ZEA总质量。

ZEA负载量=添加的ZEA质量-上清液中ZEA质量-水洗液中ZEA质量

(1)

(2)

1.3.3 ZEA毒素检测方法[23]

本实验使用1200高效液相色谱-6410三重四级杆质谱联用仪，来测定样品中提取ZEA毒素含量。建立了ZEA液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。

色谱条件：Agilent ZORBAX Bonus-RP色谱柱(50 mm×2.1 mm，3.5 μm)，柱温 45 ℃，进样量 50 μL；流动相为10 mM 乙酸铵水溶液 (A)和乙腈 (B)，梯度条件：0～0.1 min，B为10%；0.1～2 min，B由10%升到50%；2～10 min，B由50%升到80%；10～15 min，B为80%；15～16 min，B由80%降至10%；16～20 min，B保持10%。电离模式、监测离子对(m/z)和其他参数见表1

质谱条件：离子化模式采用电喷雾电离正离子模式(ESI+)和负离子模式(ESI-)；质谱扫描方式选择多反应监测(MRM)；正离子模式(ESI+)喷雾电压为4500 V；负离子模式(ESI-)喷雾电压为2 500 V；离子源温度 450 ℃；气帘气8 L/min。

表1 ZEA毒素的质谱参数

注：※.定量离子。

1.3.4 实际样品的应用1.3.4.1 实际样品中ZEA毒素的提取[21]

称取玉米粉样品25.0 g(精确至0.1 g)于500 mL具塞锥形瓶中,加入100 mL70%甲醇溶液(V/V)，浸泡15 min，超声振荡40 min，过滤得到样品提取液A,取2 mL滤液用48mL PBS溶液稀释，得到提取液B。

1.3.4.2 免疫亲和柱对实际样品的应用[21]

取16 mL 提取液B，以2 mL/min的速度过免疫亲和柱，再用16 mL H2O以5 mL/min的速度洗涤柱子；用1 mL 100%甲醇溶液(V/V)以1 d/s的速度洗脱柱子，将洗脱液收集于2 mL的样液瓶中，再用1 mL H2O以5 mL/min的速度洗涤免疫亲和柱，同样收集于上述样液瓶中。用Agilent 1200-ESI 6410液相色谱-质谱联用仪上机检测，进样量为50 μL。

1.3.4.3 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠对实际样品的应用

取100 mg Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠于50 mL离心管中，先用超纯水洗涤两次，用磁铁收集磁珠除去水洗液。然后加入30 mL提取液B，振荡反应30 min，用磁铁收集磁珠去除上清液，加入20 mL超纯水以10 mL/次洗涤磁珠两遍。最后加入30 mL甲醇以10 mL/次洗涤3次，收集三次的醇洗液，用Agilent 1200-ESI 6410液相色谱-质谱联用仪分别测定三次甲醇洗脱液中的ZEA毒素浓度，根据醇洗液体积，计算甲醇解吸液中的ZEA总质量。

2 结果与讨论

2.1 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的鉴定

2.1.1 SEM表征

用场发射高分辨扫描电子显微镜进行观察。图1(a、c)所示的是Fe3O4微球的SEM图片，Fe3O4磁核粒径在100～300 nm 之间，磁核成球不稳定，有些磁核呈不规则状。由于磁核性质较为活泼和外加磁场分离过程中导致的部分磁珠磁化，使得磁核易发生团聚，分散性不好。图1(b、d)是Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的SEM图片，对比Fe3O4磁核的SEM图片，可以看出不规则状磁核的棱角被钝化，图1(b、d)中这些包覆后的磁核都趋于球形，磁核表面也由光滑变得粗糙。通过对比分析磁核包覆前后的SEM图片，可以看出图1(b、d)中磁核表面有包覆物存在。

图1 Fe3O4微球(a、c)Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠(b、d)SEM表征图

2.1.2 红外光谱表征

图2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的红外光谱图

2.2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的负载量及重复性使用的效果评价

按照1.3.4.3的方法对Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠重复使用3次，计算每次使用的负载量和回收率。结果见表2，发现每100 mg Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的ZEA毒素负载量为3μg左右，随着使用次数的增加，负载量逐渐下降。这是因为一方面洗脱剂甲醇会对抗体结构造成破坏，使得部分抗体活性降低甚至失活，部分抗原抗体结合能力减弱或消失；另一方面，由于部分ZEA毒素未能从抗体上洗脱掉，使得抗原抗体的部分结合位点被占据，导致毒素能够结合抗体的位点减少，负载量下降。

通过对三次重复使用的效果分析，可以发现Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠对ZEA毒素有高效的吸附能力，毒素的解吸效果良好，可以实现较高回收率且具有可多次重复性使用的优点。

表2 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠重复使用3次的吸附及洗脱情况

2.3 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠添加回收率评价

按照1.3.4.1和1.3.4.3的方法，选择c样品玉米粉进行ZEA毒素的添加回收率实验,添加回收率计算公式见(3)，添加水平分别为30、60、90 μg/kg，每个水平进行6次重复实验。结果见表3，C样品玉米粉3个水平的添加回收率在84.61%～90.00%之间，相对标准偏差为4.86%～9.44%，符合痕量分析的要求，说明制备的Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠能用于实际样品的纯化。

(3)

式中：P表示ZEA毒素的添加回收率，m2为25 g样品添加标品后检测到的ZEA毒素总质量，m1为25 g样品本底ZEA毒素质量，m为25 g样品中添加的ZEA毒素标品质量。

表3 Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠纯化C样品中ZEA毒素的添加回收率

2.4 DZTMS-PREP免疫亲和柱和Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的实际应用效果比较

按照1.3.4.1的方法分别对市面上6种玉米粉中ZEA毒素进行提取，然后分别采用1.3.4.2和1.3.4.3对6种样品提取液中ZEA毒素进行纯化，每组实验重复3次，按照1.3.3方法进行检测。结果见表4，通过Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠和DZTMS-PREP免疫亲和柱两种前处理方式分别对实际样品进行纯化，结果显示采用两种前处理方式检测到的ZEA毒素在样品中的分布规律是一致的，说明制备的ZEA单抗磁珠有较好的使用效果。

根据食品安全国家标准GB 2761—2017[24]规定，玉米粉中玉米赤霉烯酮ZEA的限量指标是60 μg/kg，所以6种样品中b样品ZEA含量超标。

表4 免疫亲和柱和Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠两种方法对6种玉米粉纯化后ZEA毒素的检测结果

注：x为平均值；y为标准偏差。

3 结论

本研究将金属有机框架材料制备简单、可以固定抗体的特性和Fe3O4纳米磁珠便于收集的优势结合起来，通过对磁珠包覆技术的研究，将偶联了ZEA单抗的金属有机框架材料AMP&ZnCl2成功包覆在Fe3O4纳米磁珠表面，制备了一种新型的Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠。通过电镜和红外两种表征方法对Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的进行了鉴定。验证并确定了制备的Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的ZEA毒素负载量为3 μg/100 mg左右，随着使用次数增加，负载量会有所下降。使用Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠对c样品玉米粉进行了3个水平的添加回收率实验，该样品的添加回收率在84.61%～90.00%之间，相对标准偏差为4.86%～9.44%，符合痕量分析的要求。最后选择了6种玉米粉，与免疫亲和柱的纯化效果进行比较，从结果可以看出Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠对样品的纯化效果和免疫亲和柱的纯化效果基本相同。因此，Fe3O4@AMP&ZnCl2·ZEA单抗磁珠的制备是成功的，且具有良好的使用效果，可以应用于实际样品的纯化。