通过调节蛋白酶K消化时长优化DNA提取方法

吴松芳，陆宜隽

（1.上海市徐汇区中心医院，上海 200031；2.上海市位育中学，上海 200231）

蛋白酶K在多种环境下都能够具有一定的活性，同时化学性质也较为稳定，因此在生物工程中的应用较为广泛。蛋白酶K可以用来进行DNA提取操作，也可以用于对蛋白的修饰。由于蛋白酶K属于酶类的一种，其活性相对较高，可以用于对蛋白的降解。另外，DNA提取是生物工程和生物技术中较为常用的一种重要的操作，应该采用重要的方法和措施保证DNA提取的质量，保证生物工程的质量。利用蛋白酶K进行DNA的提取就是重要的方法之一，并可以通过调节蛋白酶K的消化时长，从而对DNA的提取过程进行干预，这样能够在很大程度上提高DNA的提取质量，本文对此进行了较为详细的分析。

1 DNA提取概述

1.1 DNA提取原则

采用物理及化学方法提取组织DNA，主要遵循以下提取原则：(1)保证核酸一级结构的完整性；(2)保证其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；(3)核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；(4)其他核酸分子如RNA等，也应尽量去除。

1.2 DNA提取原理

较为常见的是研溶法提取DNA。首先研磨破坏细胞壁和细胞膜，使得核蛋白和RNA释放出来；再利用DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液而RNA溶于0.14mol/L的NaCl溶液的性质，将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品破碎细胞液中分开；最后将蛋白的杂质除去。

1.3 DNA提取鉴定方法

1.3.1 分光光度法

在260nm和280nm处测定DNA溶液的光吸收，A260与A280之比应在1.75-1.80之间。低于此值表明制备物中残留蛋白质成分较高或含有酚，高于此值表明有RNA的残留。

1.3.2 凝胶电泳分析

影响琼脂糖凝胶电泳DNA迁移率的因素：①DNA分子大小，DNA分子越大迁移速度越慢。②迁移率与琼脂糖浓度成反比。③DNA构象：a.相同分子量的超螺旋环状（Ⅰ型），切口环状（Ⅱ型），线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶。b.一般情况下，迁移率Ⅰ型＞Ⅲ型＞Ⅱ型。④电压：迁移率与所加电压成正比，但是电压过大有效分离范围减小。⑤电场方向：单一方向速率均等，改变方向，极大分子DNA迁移更慢。通过脉冲电场凝胶电泳分离极大DNA。

在DNA提取的过程中，为了保证DNA的提取质量，应该遵循一定的原则[1]。DNA提取的原则相对较多，应该对各种原则合理准确把握，保证DNA的提取质量符合相关的要求，对于DNA标本指的是标本的采集、标本的保存、标本的运输。实验前的质量控制是整个基因检测后续运行的保障，其中任何一环出现问题都将影响后续实验的运行，甚至让实验无法进行。DNA提取实验是将合格样本的DNA提取出来的一系列操作，实验中质量控制是DNA提取的核心。

此外，DNA提取全程都要注意防止样品污染（环境与样品的污染和样品与样品的污染），这将关系到实验结果的可信度。在DNA提取的实验后，则是对DNA的保存。DNA的完整保存可以用于进行聚合酶链式反应（PCR），进行特殊DNA片段的体外扩增，从而制造特定的DNA序列满足特定反应。DNA的保存是对PCR的完善[2]，可以随时查找样本DNA进行DNA扩增。一般DNA提取出来后，根据特定的DNA应用进行不同程度的保存，制备保存液进行保存内置DNA保存液，短期内使用将放置于4℃进行保存，长期保存将放置于-20℃下进行保存，减缓DNA降解速度。

2 蛋白酶K的反应原理及消化时长

蛋白酶在生物工程中具有重要的应用，是一种常用的酶类，尤其在DNA的提取操作中具有重要的应用。蛋白酶的种类也很多，可以应用在不同的场合中，同时不同酶的反应原理和作用原理也存在一定的差异，对此应该进行差别对待。有些酶是从内部将蛋白质分子切断，从而实现对DNA的提取，而有些酶则是将蛋白质分解为各个游离的分子，这样也可以实现对DNA的提取[3]。

另外，采用蛋白酶在DNA的提取中，蛋白酶的反应时长对于DNA的提取具有较大的影响，对此应该重点加以对此。在实际的DNA提取中，可以通过调整和改变蛋白酶的相应的消化时长，从而实现对DNA提取过程中的干预，达到提高相应的提取质量。蛋白酶K是由多种氨基酸所组成的，并具有两个不同的结合点，这样的分子结构也决定了这种蛋白质的化学性质较为稳定，也使得蛋白酶K能够在多种场合中都能得到广泛的采用。目前，蛋白酶K医药、食品等行业中得到了较为广泛的应用，制备不同材料以应用到各领域中。对于改善相应的劳动环境也具有一定的价值。

蛋白酶对于保证的环境和反应的环境也具有一定的要求，对此在实际的操作过程中，应该加以注意。对于培养基的选取，应该充分保证培养基的温度在合理的范围内，同时培养液的pH值也要在一定的范围之内，这样才可以发挥出蛋白酶的相应作用，同时也有利于蛋白酶在生物工程中的实际应用。随着生物技术的不断发展，蛋白酶的产量已经有了较大的提高，也具有相当的市场。

3 DNA提取的优化方法

3.1 常见的DNA提取方法

在提取DNA的过程中，蛋白酶K的消化时长对于DNA的提取质量有着直接的影响，应对蛋白酶K的消化时长进行合理控制，达到成功提取DNA的目的。DNA提取是基因克隆等研究的第一步，现有的方法主要是CTAB方法，此外还可以采用不同的方法，如玻璃珠法、研磨法、冻融法等物理方式，异硫氰酸胍法、碱裂解法等化学方式，酶法等生物方式。根据核酸分离纯化方式的不同，有硅质材料、阴离子交换树脂等。这些方法种类繁多，提取质量各有不同，还不能完全满足使用需求。通过调节蛋白酶K的消化时长，可以很好地优化DNA的提取，提高DNA的提取质量，保证DNA提取具有较高的纯度，同时DNA自身也没有受到损坏。

在现代疾病诊断中，核酸占据着非常重要的地位，其中DNA的作用更显突出，而血液跟组织则是获取的DNA重要来源。但是，组织提取与血液提取相比较而言，采集动物组织操作简单、不需要抗凝剂，便于保存和携带运输。所以组织提取DNA更具优势。但在PCR分子诊断过程中，获得的DNA的总拷贝数和质量会直接影响到后续检验实验的结果，所以，获得有效、可靠的DNA是PCR分子诊断的关键。虽然传统的液氮研磨和酚氯仿提取核酸的方法能够获得质量较好的核酸，但是其中用到的化学物质却有着一定的毒性，而且整个提取过程耗时较长，浪费大量的时间和人力物力。进一步来说，现在普遍使用的柱提法核酸提取试剂也能获得质量很好的核酸，毒性也可以忽略，但是耗费的时间长。除去毒性和时间的因素以外，这两种试剂提取核酸的操作当中免不了各种洗涤液的添加和丢弃，这个过程极其容易导致样本之间的交叉污染。当样本量较多的情况下，还容易出错，致使工作效率低下。

3.2 DNA提取的影响因素

蛋白酶K的应用范围较广，应用于各种生物材料制备工程中能够在不用的生物工程中都能得到应用，也是重要的蛋白酶类，同时该种酶的活性也十分高，在生物学中具有重要的价值和意义，此外能够分解多种不同的蛋白质，在采用蛋白酶进行DNA的提取中，首先应该分析各种可能影响DNA提取质量的影响因素，之后对DNA提取的质量进行分析。在分析出各种不同的影响因素之后，应该对各个因素进行采用合理的措施加以处理，保证DNA的提取质量，这样在生物工程中也具有一定的意义。DNA的提取质量受到影响的因素通常也相对较多，如设备、提取方式都会影响到实际的DNA的质量，故应该对DNA的提取加以重视，这样才可以保证DNA的提取质量。目前，采用蛋白酶对DNA提取的技术也相对较为成熟，可以在实际的工程中加以推广。蛋白酶K在高温(达65℃)和宽pH范围（pH7.5～12.0）具有高稳定性。在脲、SDS等变性剂存在下其活性得以提高。上述性质使得蛋白酶K在要求非特异性蛋白质降解的生物技术领域中具有很好的应用，特别是从粗提取液中分离核酸（DNA或RNA）以及在DNA分析中预制备样品，另外蛋白酶K也可应用于蛋白质分析领域，例如结构释析。其中，用于DNA提取的试液包括盐酸胍、乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、盐酸和2-丁氧乙醇，pH值为6.8～7.2。本发明所述的洗涤液能够广泛去除不同植物在基因组纯化过程中的多糖、多酚等污染，提高纯化所得DNA的纯度与浓度，有利于下游应用，提高检测灵敏度。

3.3 DNA提取的优化方法

DNA的提取方法较多，不同的提取方法具有不同的特点，对此应该合理差别化对待。采用蛋白酶K进行DNA的提取，其反应的原理不复杂，一般是通过蛋白酶进行反应，从而将DNA加以分离将DNA分解出来，实现对DNA的提取。但蛋白酶不同的反应时长，对于DNA的提取具有较为显著的影响，对此应引起重视，同时在实际的DNA提取操作中，也可以通过调整和改变时长，通过采用不同的反应时长，达到对DNA提取操作过程中的实际控制，提高对DNA提取的实际控制。蛋白酶K应在真空或37℃温箱或室温干燥，加TE缓冲液20μL。溶解后，取3～8μL 用于PCR扩增，或放-20℃保存，具有良好的重复性与稳定性。但操作繁复，技术要求高。用于蛋白酶K保存的缓冲液，所述缓冲液中，除水外，还包括下列组分：Tris 10 mmol/T-500 mmol/LCa2+2 mmol/L-50 mmol/LHCl调节pH值至7.5-8.4，甘油30%～60%。在提取DNA时，可以通过调节蛋白酶K的消化时长，以提高对DNA的提取质量。

4 结语

随着生物技术的不断发展，生物产品的质量也会得到较为明显的提高，本文主要对DNA的提取进行了分析。在DNA的提取过程中，采用不同的提取方法对于提取的DNA的产品质量具有较为明显的影响，当采用蛋白酶K对DNA进行提取时，应该对蛋白酶的消化时长进行控制，保证DNA的提取具有较高的质量，这样才可以达到对DNA成功提取的目的，保证产品的质量符合相关的要求。

蛋白酶K在生物工程中具有重要的应用，在DNA的提取中常采用蛋白酶K进行辅助操作。在提取DNA时，如不加蛋白酶K的话细胞是很难裂解释放DNA的，DNA浓度会很低，除非使用煮沸法或超声破碎法，本文对通过调节蛋白酶K消化时长进行DNA提取的方法进行了详细的分析，对于提高DNA的提取工艺具有一定的价值。