一种玉米赤霉烯酮免疫磁珠分离富集试剂盒的研制

刘玉梅 王兆芹 贾芳芳 万宇平杜美红 张 瑜 冯月君 张 颖 何方洋*

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)为一种白色结晶，又称F-2毒素，是由禾谷镰刀菌等菌种产生的有毒代谢产物。ZEN主要污染玉米、高粱、小麦、大麦等粮谷类作物及其制品。受到ZEN污染的乳制品、肉制品等动物源性食品，会对动物及人类造成危害，主要表现在影响和破坏生长发育及生殖系统方面，人畜误食含有该毒素的食物后，会引起雌性激素中毒症，造成生殖系统的严重损伤。此外，ZEN及其衍生物对肝脏系统，免疫系统均有很大的危害，并且有引发肿瘤的可能性[1-2]。目前大多数国家对食品、谷物、饲料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分严格的规定。例如澳大利亚规定谷物中玉米赤霉烯酮的含量不能超过0.05mg/kg；意大利规定在谷物和谷类产品中玉米赤霉烯酮的含量不能超过0.1mg/kg；而在法国，植物油和谷类当中玉米赤霉烯酮的含量必须低于0.2mg/kg。中国则规定配合饲料、玉米中的玉米赤霉烯酮含量不得超过500ng/g。

玉米赤霉烯酮的分析测定一般采用薄层色谱法(TLC)、酶联吸附免疫法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC)[3-9]。TLC法繁琐费时，且灵敏度、特异性较差，提取过程中所需有机溶剂品种多且量大，易污染环境，对人体有较大危害。常规的HPLC法虽然比TLC灵敏度高，但由于样品前处理手续繁琐，操作复杂，不宜推广。本文研究的玉米赤霉烯酮免疫磁珠分离富集方法是通过内含四氧化三铁的纳米磁珠表面修饰官能团与玉米赤霉烯酮抗体结合，在外加磁场作用下，从混合溶液中富集、分离玉米赤霉烯酮，操作步骤简单，实验成本较低。本研究利用免疫磁珠分离技术检测谷物中的玉米赤霉烯酮残留量，为致力于食品安全检测的基层实验室提供检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 玉米赤霉烯酮标准品CAS：17924-92-4：购自北京标准物质研究中心；对苯二胺、乙酸乙酯、亚硝酸钠、盐酸、牛血清白蛋白(SA)、鲁米诺：购自北京百欣试剂公司；玉米：市售；小鼠脾细胞、玉米赤霉烯酮残留酶联免疫检测试剂盒(以下简称ELISA试剂盒)：来自北京勤邦生物技术有限公司。

1.1.2 仪器与设备 MX-F涡旋仪(湖南湘立科学仪器有限公司)、MK3酶标仪(上海雷勃分析仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 制备抗原 （1）半抗原的制备：将110mg对苯二胺溶入15ml 0.2mol/L的HCl水溶液中，0～4℃下滴加70mg NaNO2的2ml水溶液，避光反应0.5～1h，然后缓慢滴加110mg玉米赤酶烯酮在2ml 0.5mol/L醋酸钠水溶液中的混合物。避光反应1～3h。加入适量浓盐酸酸化，产生沉淀，离心，水洗，乙酸乙酯提取，除去溶剂后得到玉米赤酶烯酮的偶氮衍生物，得到玉米赤霉烯酮半抗原，得率65%。玉米赤霉烯酮半抗原的合成路线见图1。（2）免疫原的制备：取20mg玉米赤霉烯酮半抗原用2ml水溶解，得到溶液A，取50µl戊二醛逐滴加入到溶液A中，室温搅拌反应24h。取BSA50mg用4ml水溶解，得到溶液B，将溶液A缓慢加入到溶液B中，室温搅拌反应过夜。加入430mg NaBH还原，用0.02mol/L的PBS透析3d，更换透析液3次/d，得到所述玉米赤霉烯酮人工抗原，分装后-20℃保存备用。

附图 玉米赤霉烯酮半抗原合成

1.2.2 制备单克隆抗体、偶联单抗的磁珠 将1.3.1得到的玉米赤霉烯酮免疫原依次进行动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞筛选、单克隆抗体制备等操作[10]，最终得到玉米赤霉烯酮单克隆抗体。取100µl羧基磁珠(购于DYNAL，粒径为2.8µm，含量是0.15eq/g)于离心管中，用100µl含0.05%吐温-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗涤2次，磁分离后移除上清；用4℃贮存的pH5.0、25mmol/L MES溶液分别配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分别加入50µl新配制的EDC和NHS溶液到装有磁珠的离心管中，涡旋混匀，室温活化30min，磁分离后移除上清，MES溶液洗涤2～3次；将玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶解到60µl pH5.0、25mmol/L MES溶液中，用所述MES溶液调节总体积至100µl，轻柔加入到已活化磁珠中，室温偶联30min或4℃偶联2h，期间使磁珠保持混匀状态；磁分离后移除上清，加入100µl pH7.4的TRIS溶液反应15min封闭磁珠；磁分离后移除上清，用100µl含0.1%～0.3%BSA、0.1%吐温-20的TRIS溶液洗涤封闭好的磁珠3～5次，磁分离后移除上清，将磁珠复溶于含0.1%～0.5%BSA、0.01%～0.1%吐温-20、0.02% NaN3的TRIS溶液中(浓度为10mg/ml)，2～8℃保存备用。所述百分含量为质量百分含量。

1.2.3 试剂盒对样本中玉米赤霉烯酮的分离富集方法（1）样品前处理：用均质器均质样品；称取5.0±0.05g样品至样品瓶中，分别加入1.0±0.05g氯化钠，25ml 60%甲醇溶液，用涡旋仪涡旋5min，或者摇床震荡20min，3000g以上，室温(20～25/68℃～77)℉离心5min；(如不具备离心条件，该步骤也可用如下操作替代：静置后取10ml上清液过滤)吸取5ml(相当于1g样品)离心上清液/滤液，加入5ml去离子水，混匀，待用(用于磁珠捕获)。（2）免疫磁珠捕获：取玉米赤霉烯酮免疫磁珠0.2ml于10ml离心管中，用5ml去离子水润洗磁珠2次，每次用磁分离架分离洗液(每次在磁分离架上静置3min，确保磁珠全部吸附)；向润洗好的玉米赤霉烯酮免疫磁珠中加入处理好的样本5ml，混匀，25℃，20min，期间5min混匀一下磁珠；用磁分离架分离免疫磁珠，用去离子水液冲润洗免疫磁珠2次，每次5ml(方法同免疫磁珠润洗)。（3）免疫磁珠洗脱：用1ml甲醇洗免疫磁珠，混匀，静置1min，用磁分离架分离免疫磁珠，回收甲醇液，即为富集净化后的玉米赤霉烯酮样品，应用于酶联免疫吸附法检测的快速测试。

1.2.4 试剂盒的捕获量和回收率测定方法 试剂盒的捕获量的定义为：每毫克偶联玉米赤霉烯酮单克隆抗体的磁珠可以捕获玉米赤霉烯酮的最大量。取上述步骤制备的富集玉米赤霉烯酮的免疫磁珠0.1ml(浓度为10mg/ml)于10ml离心管中，用5ml去离子水润洗磁珠2次，磁分离后移除上清；然后加入1ml待测样品(将玉米赤霉烯酮标准品用PBS缓冲液分别配制成浓度为10、20、30、40、50、60、70、80ng/ml的玉米赤霉烯酮溶液作为待测样品，并以PBS缓冲液作为空白待测样品)，混匀，25℃捕获20min，期间5min混匀一下磁珠；磁分离后移除上清，用5ml去离子水润洗磁珠2次，除去干扰杂质。最后加入1ml甲醇洗脱，收集洗脱液，用ELISA试剂盒检测待测样品中玉米赤霉烯酮的含量。

1.2.5 试剂盒的特异性测定方法 以玉米赤霉烯酮作为标准，设玉米赤霉烯酮的交叉反应率为100%，用于试剂盒交叉反应性研究的药物均为与玉米赤霉烯酮结构或者功能相似的竞争药物：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素。玉米样本中分别添加上述6种药物(包括玉米赤霉烯酮)浓度为50ng/ml，按照试剂盒步骤操作，对样本中玉米赤霉烯酮进行分离富集后，利用ELISA试剂盒方法对样本进行检测。

2 结果与分析

2.1 试剂盒的捕获量

样本中玉米赤霉烯酮浓度为10、20、30、40、50ng/ml时，经玉米赤霉烯酮免疫磁珠分离富集试剂盒对样本中玉米赤霉烯酮分离富集后，再经ELISA试剂盒进行检测，得出玉米赤霉烯酮添加回收率范围为85.4%～93.8%；样本中玉米赤霉烯酮浓度为60、70、80ng/ml时，得出玉米赤霉烯酮添加回收率范围为72.1%～82.9%，表明玉米赤霉烯酮免疫磁珠分离富集试剂盒对样品中玉米赤霉烯酮的捕获量为50ng/ml。

表1 偶联玉米赤霉烯酮单克隆抗体的磁珠捕获量和样品添加回收率

2.2 特异性

按照1.2.5步骤，利用ELISA试剂盒方法对样本进行检测，检测结果见表2。

表2 试剂盒特异性试验 (ng/ml)

从表2可以看出，试剂盒对玉米赤霉烯酮具有较高的特异性，对与玉米赤霉烯酮结构或者功能相似的竞争药物均无交叉反应。

2.7 讨论

目前，在检测方法中，一般都需要对目标物进行前处理，达到分离富集的作用。较常用的前处理净化装置，包括免疫亲和柱、C18固相萃取柱等[11-23]。以上净化装置费用较高，不适于基层实验室大量使用。本研究的玉米赤霉烯酮免疫磁珠分离富集试剂盒价格合适，用于后期检测的灵敏度也较好。

3 结论

本研究制备了抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体，并研发出玉米赤霉烯酮免疫磁珠分离富集试剂盒，试剂盒对样品中玉米赤霉烯酮的捕获量为50ng/ml，与玉米赤霉烯酮结构或者功能相似的竞争药物：黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素M1、T-2毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素等5种药物进行特异性反应时，均无交叉反应，说明试剂盒对玉米赤霉烯酮具有较高的特异性。