耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌耐药机制研究及多位点序列分型

张雨晨，周树生，王春艳，查 渝，曹晓光，黄 羽，王贤聪

鲍曼不动杆菌是院内重要的机会致病菌，尤其在ICU中常导致危重病人的感染[1-2]。碳青霉烯类抗生素一直被认为是治疗各种感染的重要抗生素，然而近年来碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumannii,CRAB)分离株的比例却在逐渐升高[3]。2016年中国CHINET细菌耐药性监测显示鲍曼不动杆菌占所有分离菌株的第三位[4]。2005年到2016年，我国鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率从31.0%上升至68.6%，对美罗培南的耐药率从39.0%上升至71.4%[4-5]。对碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌往往对其他常见的抗生素也同时耐药，这使得临床上治疗CRAB变得更加困难。该研究通过收集ICU病区的CRAB探索鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类药物的耐药机制，同时进行多位点序列分型(MLST)探究其同源性，为院内爆发性感染进行预防控制奠定基础。

1 材料与方法

1.1菌株来源收集2017年安徽省立医院ICU病区患者标本分离的CRAB菌株共28株。同一患者同一部位分离的菌株不重复计入。

1.2实验试剂主要试剂包括菌种保存管(北京友康恒业生物科技有限公司)；细菌基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；2×Taq PCR Mix(上海近岸科技有限公司)；琼脂糖(西班牙Biowest公司)；DNA分子量 Marker及Loading Buffer(6×)(日本TaKaRa公司)；K-B法药敏纸片(英国OXOID公司)；E-test试纸条(温州市康泰生物科技有限公司)；MH琼脂平板(江门凯林贸易有限公司)。

1.3主要仪器主要仪器包括VITEK-2 COMPACT 全自动微生物分析仪(法国生物梅里埃公司)；PCR扩增仪(德国Biometra公司)；水平凝胶电泳仪(美国Bio-Red公司)；凝胶成像及分析系统(上海Biotop公司)；微量高速离心机(德国Sigma公司)；麦氏比浊仪(法国生物梅里埃公司)；恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)。

1.4菌株的鉴定与收集使用VITEK-2 COMPACT 全自动微生物分析仪进行菌株鉴定与药敏试验。质控菌株为大肠埃希菌(ATCC25922)和铜绿假单胞菌(ATCC27853)。使用菌种保存管收集菌株，于-80 ℃冰箱保存。

1.5K-B纸片法及E-test法复测药敏结果采用K-B纸片法或E-test法对CRAB进行体外药敏。根据2017年美国CLSI标准判读药敏结果，耐药表型见表1。

表1 鲍曼不动杆菌的耐药表型(n=28)

1.6碳青霉烯酶表型筛查实验参照文献[6]报道的方法，采用碳青霉烯酶抑制实验(CIM)检测，若大肠埃希菌的生长未受到抑制，即无抑菌圈存在，则为产碳青霉烯酶的菌株；反之则为不产碳青霉烯酶的菌株。

1.7细菌基因组DNA的提取取菌株保存管的菌株于5 ml无菌LB培养液中摇菌(37 ℃、220 r/min、16 h)，采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株DNA，-20 ℃冰箱保存备用。

1.8引物的合成由安徽通用生物系统有限公司合成β-内酰胺酶耐药基因引物及7个等位基因引物[7]，见表2。

1.9基因检测与基因序列分析所有基因的检测采用PCR法。PCR反应体系为：每反应体系引物1、2各2 μl，DNA模板1 μl，2×Taq PCR Mix 25 μl，无酶水20 μl，总体积为50 μl。PCR反应参数：94 ℃预变性90 s，94 ℃变性20 s，退火温度20 s，72 ℃延伸1 min/kb，30个循环， 72 ℃延伸5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳(100 V、45 min)后在凝胶电泳成像仪下观察，并记录结果。阳性结果的PCR反应体系送至安徽通用生物系统有限公司进行基因测序，并将耐药基因测序结果在BLAST上比对。

表2 PCR引物序列

1.10MLST数据分析采用Oxford法将7个等位基因的测序序列提交至pubmlst网站进行在线序列比对，并获得对应的等位基因号(allele number)及序列型(sequence type,ST),应用eBURST软件对数据进行分析。

2 结果

2.1标本基本情况分析患者年龄20～82(58.3±17.5)岁，男20例(71.4%)，女8例(28.6%)。28株CRAB均来自ICU同一病区，其中25株分离自痰标本，1株分离自血标本，2株分离自引流液标本。

2.2药敏试验结果28株CRAB对亚胺培南和美罗培南全耐药，除对多黏菌素、替加环素和米诺环素有较高的敏感率，对其他14种抗生素均高度耐药，见表1。

2.3CIM结果28株CRAB菌株CIM结果均为阳性，见图1。图中MH培养基均匀涂布0.5麦氏的大肠埃希菌ATCC25922，3张亚胺培南纸片分别经3株样本菌株孵育后，加入MH平板上，大肠埃希菌ATCC25922生长未受到抑制，即未出现抑菌圈。

图1 部分CRAB碳青霉烯酶抑制实验结果

2.4β-内酰胺酶耐药基因检测结果28株CRAB均含有blaOXA-51和blaampC，25株(89.3%)菌株携带blaOXA-23，14株(50%)菌株携带blaTEM。未检测出blaNDM-1、blaKPC和blaSHV等其他基因。随机抽取部分blaOXA-51、blaampC、blaOXA-23和blaTEM基因PCR产物进行测序，并将测序结果在BLAST比对，结果均对应上述4种基因，见图2、3。

2.5MLST结果将28株CRAB进行MLST分型，得到9种ST型，其中ST1789、ST1790、ST1791和ST1792为新的ST型，见表3。采用eBURST软件进行分析，得到一个同分型组及两个单体(ST1790和ST1792)，见图4。图中ST369为各ST型共同的祖先(Founder)，与其亲缘关系较近的单位点变异株(SLVs)为ST191、ST195、ST368、ST369、ST1789以及ST1791。

表3 MLST结果

*表示新发现的ST型

3 讨论

鲍曼不动杆菌在全球的广泛播散受到越来越多的关注，世界卫生组织已将鲍曼不动杆菌判定为ESKAPE中最严重的细菌之一。2012年中国CHINET监测数据显示，国内不同地区15所医院临床分离的鲍曼不动杆菌约1/4来自于ICU病区[8]。本研究收集了ICU病区共28株CRAB，患者平均年龄为58.3岁，标本来源以痰标本为主，说明患者年龄较大和自身免疫力差是鲍曼不动杆菌感染的重要危险因素，且鲍曼不动杆菌感染以呼吸系统为主，这与王涛、郭勇 等[9-10]的研究结果一致。

图2 部分菌株PCR电泳图片M：DNA Marker；1～15：不同菌株目的基因扩增条带

图3 4种基因部分测序图片

A：OXA-23基因部分测序图片；B：OXA-51基因部分测序图片；C：TEM基因部分测序图片；D：ampC基因部分测序图片

图4 eBURST软件分析结果图

本研究结果显示，28株CRAB对哌拉西林、头孢他啶、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢曲松、环丙沙星和哌拉西林/他唑巴坦均耐药，仅有4株(14.3%)对甲氧苄啶/磺胺甲恶唑敏感，2株(7.1%)对四环素敏感，2株(7.1%)对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星和左氧氟沙星同时敏感，然而28株CRAB对多黏菌素、替加环素和米诺环素具有很高的敏感率(92.9%～100%)，提示CRAB对常用抗生素的耐药率较高。因此，应高度重视ICU鲍曼不动杆菌引起的感染，根据药敏结果合理使用抗生素。

鲍曼不动杆菌的耐药机制复杂，目前国内外研究表[11]明产生水解碳青霉烯类的β-内酰胺酶是其最常见的耐药机制，其中最常见的是D类OXA型碳青霉烯酶。本研究结果显示28株CRAB均携带blaOXA-51和blaampC，25株(89.3%)携带blaOXA-23，14株(50%)携带blaTEM，这与王辉 等[12]的研究结果相近，说明本院CRAB携带的β-内酰胺酶耐药基因与全国总体一致。

采用Bartual et al[13]建立的MLST方案进行同源性分析，结果得到9种ST型，其中ST1789、ST1790、ST1791和ST1792为新的ST型。经过eBURST软件分析得到一个同分型组及两个单体，其中ST191、ST195、ST368、ST369、ST1779、ST1789和ST1791具有同源相关性。本研究结果显示ST1779(28.6%)、ST195(17.9%)以及ST1789(21.4%)为主要感染株，提示本ICU鲍曼不动杆菌感染存在流行趋势。

目前已经发现的细胞间转移机制有转化、转导以及结合等形式,而结合是常见的传播耐药性的机制[14]。耐药基因可以通过转座子或者质粒在细菌之间传播，从而导致多重耐药菌的流行。因此，应加强各种医疗器械及医疗用品的消毒管理，提高医务人员的手卫生意识，严格执行无菌操作及消毒隔离，防止患者交叉感染；同时应根据药敏结果合理使用抗生素，减少以及延缓耐药菌的出现[15]。总而言之，ICU病区CRAB检出率较高，耐药性较强，耐药机制复杂，应加强消毒隔离，合理使用抗生素，持续监测防止其暴发流行。