我国利什曼原虫伽师株有毒力和无毒力前鞭毛体定量蛋白质组学比较分析

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内脏利什曼病(黑热病)是由亲内脏的利什曼原虫感染所致的严重危害人类健康的重要人兽共患寄生虫病。利什曼病由媒介白蛉叮咬传播。初始感染媒介的利什曼原虫位于白蛉胃肠道，并无感染力，经过发育繁殖利什曼原虫逐渐获得了感染力，一周后原虫向白蛉消化道前部运动，并聚集在白蛉咽、口腔和喙部，当白蛉叮咬人时将利什曼原虫注入人体，侵入人体巨噬细胞而感染。因此，比较利什曼原虫有毒株和无毒株前鞭毛体表达分子差异将有助于鉴定涉及感染的利什曼原虫关键分子。

利什曼原虫基因表达主要表现为转录后和翻译后调节,导致了基因、mRNA和蛋白质表达间相关性程度极低[1]。通过对同一分离株的有毒株和无毒株进行蛋白质组学比较分析则易于发现和鉴定与感染相关的蛋白分子。利什曼原虫在培养基中培养会逐渐失去毒力，最终失去对动物模型的感染力，这些无毒株相似于媒介白蛉消化道内无感染力的前鞭毛体；而分离的利什曼原虫经动物传代(取感染动物的脾脏置培养基中培养，获得的前鞭毛体再感染动物，如此反复)其前鞭毛体能始终保持着毒力。

非标记(Label-free )定量蛋白质组学技术是近年发展起来的较敏感的蛋白质组学技术， 得到了广泛的应用[2]。本研究采用此蛋白质组学技术比较分析了分离于我国新疆伽师县黑热病患者的利什曼原虫(婴儿利什曼原虫，致荒漠型黑热病[3])有毒株和无毒株蛋白质表达的差异，其结果为筛选和鉴定与利什曼原虫感染相关的关键分子奠定了基础。

1 材料与方法

1.1虫株 婴儿利什曼原虫伽师株(MHOM/CN/08/JIASHI-5)于2008年分离于新疆伽师县黑热病患者，经鉴定为婴儿利什曼原虫[3]。该地为荒漠型内脏利什曼病疫区。该虫株通过两种方式在本实验室传代，一是每3个月感染1次金色仓鼠(购买自上海松江淞联实验动物厂，由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所动物中心饲养，经过该所实验动物福利伦理委员会审批同意使用)，即取感染鼠脾脏体外3代次培养，获取前鞭毛体再感染鼠，使其始终保持感染力(有毒株)，二是从2008年开始一直在NNN培养基中培养，每月传代1次，其前鞭毛体已失去了对动物模型的感染力(无毒株)。

1.2试剂与仪器 199培养基干粉购自德国Gibco，胎牛血清购自美国ScienCell，Hepes购自上海怡成生物科技有限公司，琼脂粉购自香港Gene Company Ltd.，青霉素钠、链霉素购自石家庄华北制药股份有限公司，氯化钠、氯化钙、氯化钾、磷酸氢钠及葡萄糖购自北京国药集团化学试剂有限公司，DTT、Urea、IAA乙腈和BCA 蛋白测定试剂盒购自美国Bio-Rad公司，Trypsin购自美国Promega公司，Q-exacitve质谱仪、HPLC液相系统EASY-nLC1000和色谱柱RP-C18购自美国Thermo公司。

1.3 培养基的配制

1.3.1NNN培养基 取新西兰兔血，去除纤维， 加入100单位/100 mL的青霉素钠。3.4 g琼脂粉、1 g氯化钠及150 mL蒸馏水配置琼脂凝胶。0.45 g氯化钠、0.01 g氯化钙、0.02 g氯化钾、0.01 g碳酸氢钠、0.125 g葡萄糖及50 mL蒸馏水配置洛克氏液。 1 mL前述兔血加入3 mL高压灭菌的琼脂凝胶，混匀后斜放在冰块上冷却，凝固形成斜面后每管再加入1 mL洛克氏液，存放于4 ℃保存备用。

1.3.2199培养基 将9.8 g M199培养基干粉加蒸馏水溶解，加入1.75 g碳酸氢钠及5.96 g Hepes，完全溶解后定容至1 000 mL。胎牛血清56 ℃灭活30 min，每100 mL M199加入20 mL胎牛血清及100单位/100 mL 双抗(青霉素及链霉素)。随后应用0.22 μm的滤膜过滤，4 ℃保存备用。

1.4有毒株和无毒株鞭毛体的收集 取婴儿利什曼原虫伽师株第一代次感染的金色仓鼠脾脏置NNN培养基培养，随后前鞭毛体再接种到199培养基中进行扩大培养。在原虫处于对数生长期，原虫密度约为106/mL时，4 ℃下以3 000 g离心15 min收集有毒株前鞭毛体，用PBS洗3次后备用。同法收集NNN培养基传代的伽师无毒株鞭毛体。

1.5蛋白质的制备 有毒株和无毒株各取100 μL压积量，分别加入500 μL STD buffer(4% SDS,1 mmol/L DTT, 150 mmol/L Tris-HCl pH8.0)，匀浆混匀，沸水浴5 min。超声破碎(80 w，超声10 s，间歇15 s，共10次)沸水浴5 min，离心取上清，BCA法蛋白质定量。取约20 μg SDS-PAGE电泳检测。

1.6蛋白质的FASP酶解 蛋白质的酶解方法参照文献[4]。取200 μg样品，加入 DTT至终浓度为100 mmol/L，沸水浴5 min，冷却至室温。加入200 μL UA buffer(8 mol/L Urea，150 mmol/L Tris-HCl pH8.0)混匀，转入10 kd超滤离心管，离心14 000 g 15 min。加入200 μL UA buffer离心14 000 g 15 min，弃滤液。加入100 μL IAA(50 mmol/L IAA in UA)，600 r/min振荡1 min，避光室温30 min，离心14 000 g 10 min。加入100 μL UA buffer，离心14 000 g 10 min重复2次。加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3，离心14 000 g 10 min重复2次。加入40 μL Trypsin buffer(4 μL Trypsin in 40 μL NH4HCO3)，600 r/min振荡1 min，37 ℃ 16～18 h。换新收集管，离心14 000 g 10 min，取滤液，OD280肽段定量。

1.7酶解产物的LC-MS/MS分析 分析方法参照文献[5]。取2 μg酶解后产物采用纳升流速HPLC液相系统EASY-nLC1000进行分离。液相A液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为2%)，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为84%)。色谱柱Thermo EASY column SC200 150 μm×100 mm (RP-C18)以100%的A液平衡。样品由自动进样器上样到Thermo EASY column SC001 traps 150 μm×20 mm (RP-C18)，再经色谱柱分离，流速为300 nL/min。相关液相梯度如下：0～110 min，B液线性梯度从0%到45%；110～117 min，B液线性梯度从45%到100%；117～120 min，B液维持在100%。酶解产物经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。分析时长：120 min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300～1 800 m/z，多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：MS1在M/Z 200时分辨率为70 000，AGC target：3e6，一级Maximum IT：10 ms，Number of scan ranges ：1，Dynamic exclusion：40.0 s；每次全扫描(full scan)后采集20个碎片图谱，二级在M/Z 200时分辨率为17 500，MS/MS Activation Type：HCD，Isolation window：2 m/z，Microscans：1，二级Maximum IT ：60 ms，Normalized collision energy：30eV，Underfill ratio：0.1%。

1.8MaxQuant查库 原始文件导入MaxQuant软件(版本号1.3.0.5)进行查库[6]。查库所用的数据库为uniprot_Leishmania_genus_50931_20160303 .fasta (蛋白质序列50 931条，下载日期20160303)。

1.9生物信息学分析 MaxQuant所得的查库文件使用Perseus软件进行分析，Perseus软件版本号为1.3.0.5。使用Omicsbean(http://www.omicsbean.cn/)进行差异表达蛋白质的生信分析，包括GO富集和KEGG富集分析[7]。

1.10统计分析 对两组样品进行t检验(双侧)，差异倍数>1.2或者差异倍数<0.83,且P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1蛋白质鉴定 利用Label-free定量蛋白组学技术共成功鉴定蛋白3 994个(舍弃只有一次有LFQ值的蛋白)，其中有毒株3 720个蛋白，无毒株3 827个蛋白。利用SPSS软件筛选出有毒株和无毒株之间差异表达蛋白，共298个(差异倍数>1.2或者差异倍数<0.83，P<0.05)，其中利什曼原虫有毒株特有表达蛋白15个，无毒株特有表达蛋白23个(图1)。二者间差异表达蛋白260个，其中有毒株表达上调蛋白78个，表达下调蛋白182个。

图1 利什曼原虫伽师有毒株和无毒株差异表达蛋白韦恩图Fig.1 Venn diagram of differentially expressed proteins between the virulent promastigotes and avirulent promastigotes in the Jiashi Leishmania strain

2.2差异表达蛋白功能注释 对有毒株和无毒株差异表达蛋白进行生物信息学分析结果显示，只在有毒株表达而在无毒株不表达的蛋白有15个，其中13个为未命名蛋白，另外2个蛋白分别是甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶(Methylmalonyl-CoA epimerase，MMCE)和乙酰转移酶，均参与代谢和生物合成。只在无毒株表达而在有毒株不表达的蛋白有23个， 其中13个为未命名蛋白，另外10个蛋白分别参与下列活动 :1)代谢和生物合成(MP67、穹隆体主蛋白、胞质FE-S簇装配因子NUBP1同源物、3-β-羟基甾体-δ(8)，δ(7)异构酶、钙蛋白酶样半胱氨酸肽酶和外切体复合物核酸外切酶Rrp40);2)定位和转运(网格蛋白装配蛋白和tRNA(鸟嘌呤(37)-N1)甲基转移酶);3)细胞膜/细胞骨架形成(动力蛋白轻链蛋白和肌球蛋白-IB重链)。有毒株表达上调蛋白主要参与细胞氮化合物代谢、细胞氮化合物生物合成、细胞酰胺代谢等生物过程；具有核酸结合、RNA结合、结构分子活性等分子功能；存在于细胞内成分、细胞质、非膜结合细胞器等细胞组分中(图2)。有毒株表达下调蛋白其功能主要涉及有机酸代谢、酮酸代谢、羧酸代谢等生物过程；具有催化活性、氧化还原酶活性、内肽酶活性等分子功能；存在于细胞内成分、细胞器、线粒体等细胞组分中(图3)。

图2 有毒株表达上调蛋白的生物学过程、细胞成分和分子功能富集图Fig.2 Biological process, cell composition and molecular function enrichment diagram of up-regulated proteins in virulent strain

图3 有毒株下调蛋白的生物学过程、细胞成分和分子功能富集图Fig.3 Biological process, cell composition and molecular function enrichment diagram of down-regulated proteins in virulent strain

2.3差异表达蛋白通路富集分析 对有毒株表达上调蛋白和下调蛋白分别进行信号转导通路富集分析，结果显示表达上调蛋白参与了核糖体、吞噬体、醚脂代谢等信号转导通路(图4)；表达下调蛋白参与了丙酮酸代谢、次生代谢物的生物合成、抗生素的生物合成等信号转导通路(图5)。

图4 有毒株表达上调蛋白的通路富集图Fig.4 Pathways enrichment diagram of up-regulated proteins in virulent strain

图5 有毒株表达下调蛋白的通路富集图Fig.5 Pathways enrichment diagram of down-regulated proteins in virulent strain

3 讨 论

本研究应用非标记高通量蛋白质组研究技术对分离于我国新疆伽师县致荒漠型黑热病的利什曼原虫有毒株和无毒株进行了蛋白质组学分析，共鉴定蛋白3 994个，远高于其他蛋白质组方法鉴定的蛋白数[8]。本研究结果显示，298个蛋白在有毒株和无毒株间的表达存在差异(特异表达或表达丰度差异)。这些差异表达蛋白中确定功能的蛋白分别参与糖与脂质代谢、核酸代谢、压力反应、细胞骨架形成、细胞周期与增殖等活动。

甲基丙二酸单酰CoA差向异构酶只在有毒株特异表达，此蛋白与降解奇链脂肪酸相关[9]。磷酸甘露聚糖酶在有毒株表达上调，此蛋白催化甘露糖-6-磷酸转化为甘露糖-1-磷酸,这是真核生物甘露醇的激活和糖复合物的生物合成的重要步骤。磷酸甘露聚糖酶缺失的墨西哥利什曼原虫失去毒力，表明该蛋白是重要的毒力因子[10]。肌醇鞘磷脂磷脂酶C(Inositol phosphosphingolipid phospholipase C-Like，ISCL)在有毒株中高表达，研究表明ISCL缺失的硕大利什曼原虫不能使易感的BALB/c小鼠感染急性期产生病理改变[11]。ISCL介导的肌醇磷酸神经酰胺(inositol phosphorylceramide，IPC)的降解在养分耗尽时对利什曼原虫的生长起重要作用，并提高利什曼原虫的耐酸机能[12]。巨噬细胞产生的活性氧和氮类物质(ROS和RNS)是杀灭细胞内病原体的最常见的武器。而利什曼原虫作为巨噬细胞内寄生的病原体具有通过抵抗感染过程中产生的有毒氧代谢物以增强生存能力的机制。在这种抗氧化机制中，多胺很大程度上取决于细胞内L-精氨酸的有效性。本研究显示在有毒株S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC)表达上调，此蛋白是利什曼原虫多胺合成的一个关键酶[13-14]。另一个上调蛋白精氨琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase，ASS)是与利什曼原虫发病机制相关的活性酶，可以将细胞内L-瓜氨酸转化为精氨琥珀酸盐以提供精氨酸，表明ASS是利什曼原虫能在压力环境中生存的重要蛋白，有望被用作抗利什曼原虫药物靶标[15-16]。上调蛋白抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)是抗氧化酶类，在分解过氧化氢中起关键作用[17-18]。无鞭毛蛋白(amastin)在有毒株高表达，此蛋白是由利什曼原虫基因组中巨大的基因家族编码的表面糖蛋白。有研究显示敲除编码无鞭毛蛋白基因的巴西利什曼原虫在小鼠巨噬细胞体外感染中表现为生长障碍而不能感染BALB/c小鼠[19]。表面蛋白2(Parasite surface antigen protein 2,PSA-2)是利什曼原虫的一个毒力因子，参与蛋白质-蛋白质相互作用和信号转导，能够抵制补体介导的溶菌作用，增强利什曼原虫感染宿主的能力[20-22]。在本研究中PSA-2在有毒株中高表达。另有研究表明杜氏利什曼原虫分离株中PSA-2的过表达导致锑剂敏感株转变为抗锑株，提示PSA-2可以作为区分对锑剂敏感株和抗性株的分子标志物[23]。

综上所述，通过比较利什曼原虫伽师有毒株和无毒株蛋白质组分析发现两者蛋白质组存在相当差异性，在有毒株高表达的蛋白大都是毒力因子，涉及利什曼原虫对宿主细胞的感染及在感染细胞中生存，从而赋予利什曼原虫毒力。下一步拟对一些有代表性的与利什曼原虫感染相关的关键分子基因进行Real time PCR验证是否在转录水平上调或下调；应用Western blot进一步证实这些关键分子的蛋白表达水平是否上调或下调，对验证成功的蛋白通过基因敲除的方法进行进一步研究，不仅可为筛选和鉴定与利什曼原虫感染相关关键分子奠定基础，而且为抗利什曼病的疫苗和药物的研究提供靶分子。

利益冲突：无