Sigma E基因对耻垢分枝杆菌五种药物敏感性的影响及机制研究

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SigE是结核分枝杆菌的重要毒力因子[1]。它在正常时不表达，在低氧、营养缺乏、偏酸偏碱等不利环境下才转录表达，参与细菌的应激反应，维持细菌生存[2]。近年的研究发现，SigE与结核分枝杆菌的潜伏与持留密切相关，灭活结核分枝杆菌的SigE会中断潜伏持留的细菌复苏过程[3]。抗生素对细菌也是一种应激，但目前关于SigE参与抗生素应激、影响抗生素敏感性及机制的报道较少。SigE是否通过促进结核分枝杆菌进入持留状态,从而影响抗生素的敏感性有待进一步研究。

本实验以耻垢分枝杆菌作为模式菌[4]，首先构建SigE表达的重组耻垢分枝杆菌，采用刃天青作为指示剂的微量滴定板法检测SigE表达菌对常用抗结核药物的敏感性。克隆表达结核分枝杆菌RpfE，抗生素诱导细菌进入非复制持留状态，利用RpfE促进持留菌的生长的作用，通过测定复苏指数来了解持留对抗生素敏感性的影响机制。

1 材料与方法

1.1质粒和菌株 pET-32a(+)质粒、 pMV261质粒、E.coliDH5和耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis，MS)由实验室保存，结核分枝杆菌H37Rv灭活样本由重庆医科大学第一附属医院呼吸科提供。

1.2主要试剂 通用型DNA纯化胶回收试剂盒、DNA marker从宝生物工程有限公司购买；限制性内切酶XhoI、EcoRI等从Themo公司购买；KODFX PCR 聚合酶买自 TOYOBO 公司；SDS-PAGE胶试剂盒从EpiZyme公司购买；小鼠抗His单克隆抗体购自Bioworld Technology公司； DAB 显色剂于康为世纪生物科技有限公司购买；异烟肼、利福平等抗生素买自北京睿博兴科生物技术有限公司。

1.3引物设计和蛋白纯化 本实验相关的测序、引物合成由武汉擎科创新生物科技有限公提供；结核分枝杆菌RpfE克隆部分由实验室完成，纯化技术部分由通用生物科技有限公司完成。

1.4sigE基因克隆与表达 设计上游下游引物扩增sigE基因(5′-ATAGAATTCCATCATCACCA TCACCATATGGAACACGACGACCGTCG-3′，5′- ACGAAGCTTTCAGGCGGACTGTGCGGTT-TC-3′，下划线为EcoR I、HindIII酶切位点，斜体为6个组氨酸编码序列。用MS为模板，-80 ℃反复冻融两次，PCR扩增条件是：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共32次循环，72 ℃ 15 min。经双酶切，再将sigE基因连接到pMV261多克隆位点构建重组质粒(pMV261-SigE)，再双酶切、测序进行鉴定正确后，电转仪调至2.7 kV、4 ms，pMV261-sigE重组质粒电转入MS感受态细菌中构建重组菌pMV261-sigE/MS，重组菌经菌落PCR验证。同时构建只含pMV261的重组菌pMV261/MS用作实验对照。将细菌培养到OD600为0.8～1.0左右，用42 ℃诱导3 h，超声碎菌，Western blot检测SigE蛋白的表达。

1.5rpfE基因克隆与表达 用MTB H37Rv灭活样本为模板，设计引物(5′- CGTCTCGAGTTGAAGAACGCCCGTACGA-3′, 5′-ATAGAATTCTCAGCCGCGGCGGCCGCAG -3′)，酶切位点分别为XhoI、EcoR I，PCR条件为：95 ℃ 8 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共34次循环，72 ℃ 10 mins；双酶切后连接到pET-32a(+)质粒中构建pET-32a(+)-rpfE重组质粒，酶切、测序鉴定正确。pET-32a(+)-rpfE转入BL21后经0.1 mol/L的IPTG诱导表达Rpf E，Western blot检测蛋白的表达。Rpf E蛋白的纯化复性由重庆通用生物科技有限公司完成。

1.6微量滴定板药敏试验[5]用灭菌蒸馏水配1%的刃天青储存液，然后过滤除菌分装，放4 ℃保存。取对数生长期的细菌7H9洗涤两次，用培养基重悬调OD600为0.5，此时菌液的浓度为4×106CFU/mL左右，取100 μL于96孔板。参考文献，稀释所需药物浓度，按100 μL/孔的量加入以上已加入菌液的96孔板中。放37 ℃孵育24 h。取刃天青稀释成0.1%，每孔加入20 μL继续37 ℃孵育12 h，在酶标仪上读取相对荧光值(激发535 nm和发射590 nm)，每个样本设定阳性对照(只加菌液不加抗生素)，阴性对照(只加7H9不加菌)，计数每孔的荧光值相对阳性对照孔的百分比。

1.7测定细菌生存率 取对数生长期的细菌用7H9洗涤2次，用培养基重悬调OD600为0.5。取500 μL菌液，500 μL稀释好的抗生素于一管，37 ℃、180 r/min培养12 h。分别在0 h、12 h，取每个浓度的菌液100 μL，7H9液体培养基等倍梯度稀释，每个稀释浓度取10 μL滴到7H9固体平板上，每次3个平行，放于37 ℃培养箱3～5 d后取出，菌落形成单位(Colony-Forming Units，CFU)计数，得到两次CFU值，计算细菌生存率比较药敏情况。

1.8复苏指数的测定[6]将细菌培养到对数生长期，调OD600一致为0.5，7H9抗性培养基洗涤菌体两次，离心后用浓度分别为异烟肼100 μg/mL、利福平25 μg/mL、乙胺丁醇10 μg/mL、左氧氟沙星10 μg/mL，环丙沙星10 μg/mL 的7H9培养基重悬，放入37 ℃、180 r/min摇床培养。24 h后8 000 r/min离心去上清，用新鲜的7H9培养基重悬，此时将重悬液平均分为两管，一管用等倍梯度稀释至106，取每个浓度的菌液10 μL滴到7H9固体平板，于37 ℃培养，3～5 d后计数CFU；另一管用加有终浓度为20 ng/mL RpfE的7H9等倍梯度稀释至1010，每浓度取200 μL于96孔板，每浓度做3个平行，96孔板边缘四周不加样，用200 μL培养基封板，将平板在37 ℃下静态培养2周，观察记录阳性细菌的孔，查表得到最大可能数(Most probable number，MPN)值[7]。复苏潜力以log10(MPN)-log10(CFU)计算的复苏指数(Resuscitation Index, RI)来表示，所涉及的7H9培养基都加有50 μg/mL的卡拉霉素。

1.9统计分析 IBM SPSS Statistics 19软件进行，数据用均值±标准差来表示，采用t检验，进行连续变量的统计学差异分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1sigE基因和rpfE基因的克隆构建和表达结果 用MS基因组作为模板，PCR扩增出大小约为744 bp的sigE基因条带(图1)，经EcoR I、HindIII酶切质粒pMV261-sigE，可见约4 400 bp 、744 bp 大小的两个片段与预期一致(图2)。灭活的MTB H37Rv菌株基因为模板扩增出519 bp 左右的rpfE基因条带(图3)，pET-32a(+)-rpfE经XhoI、EcoR I双酶切鉴定得到约519 bp，5 880 bp的两片段与预期一致(图4)。

M: DNA Marker 10 000图1 sigE基因的PCR扩增产物Fig.1 PCR product of sigE gene

M: DNA Marker 10 000图2 pMV261-SigE双酶切鉴定Fig.2 pMV261-SigE identification with double enzyme digestion

M: DNA Marker 10 000图3 rpfE基因扩增条带Fig.3 PCR product of rpfE gene

用抗His标签作为一抗(1∶4 000)，Western blot检测pMV261-sigE重组垢分枝杆菌后SigE表达，大小为32 kDa左右；pET-32a(+)-rpfE转入BL21后经0.5mmol/L IPTG诱导表达，大小为40kDa左右，与预期一致(图5)。

M: DNA Marker 10 000图4 pET-32a(+)-rpfE双酶切鉴定Fig.4 pET-32a(+)-rpfE identification with double enzyme digestion

注：M：蛋白maker；1：纯化的RpfE蛋白；2：pET-32a(+)-RpfE/BL21碎菌后的上清；3、4：分别是pMV261-sigE/MS热诱导3 h碎菌液的上清、沉淀；5、6：pMV261/MS热诱导3 h碎菌液的上清、沉淀

注：*P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。

2.2微量滴定板药敏试验 用刃天青作为指示剂，读取不同浓度药物作用后的相对荧光值，检测活菌数比例以此来监测药敏情况。与仅含pMV261空载的重组耻垢分枝杆菌对相比，pMV261-SigE重组耻垢分枝杆菌对异烟肼(isoniazid，INH), 利福平(rifampin, RIF)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB)、左氧氟沙星(levofloxacin，LVFX)、环丙沙星(ciprofloxaci，CPFX)几种抗结核药物相对荧光值高(图6)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3纯化的RpfE蛋白的活性鉴定 抗生素治疗分枝杆菌可诱导不同代谢形式的分枝杆菌产生[8]，我们用INH、RIF、EMB、LVFX、CPFX处理耻垢分枝杆菌2天，然后用添加或不添加RpfE蛋白比较耻垢分枝杆菌复苏情况，使用CFU和MPN计数，计算复苏指数评估复苏情况。显示7H9对照组未观察到有意义的复苏，复苏指数都显示为负值；而添加RpfE蛋白进行复苏的耻垢分枝杆菌复苏指数均为正值(图7)，差异有统计学意义(t(INH)=-17.00,P<0.000 1；t(RIF)=-6.37,P<0.01；t(EMB)=-3.71,P<0.05；t(LVFX)=-4.57,P<0.05)，表明有复苏活性，能促进药物诱导的持留耻垢分枝杆菌生长。

注： *P<0.05，** P<0.01，****P<0.0001。

2.4SigE表达影响药物诱导的持留菌复苏 分别用高浓度的INH、RIF、EMB、LVFX、CPFX处理pMV261-SigE/MS 和pMV261/MS 48 h，药物诱导非复制持留菌产生，然后在含有20 ng/mL RpfE蛋白的7H9促进复苏，比较两组菌复苏情况，计算复苏指数。与对照相比，INH、EMB两种药处理后SigE重组菌复苏指数是明显高于对照组(图8)，差异有统计学意义(t(INH)=5.82,P<0.01；t(EMB)=11.08，P<0.001)。

注： ** P<0.01，***P<0.001。

2.5细菌生存率检测 通过菌落计数SigE重组菌株、空载菌株药物作用前后生存率。与对照组相比，SigE表达组细菌对INH、RIF、EMB几种抗结核药物生存率高；而LVFX、CPFX 2个药物在活菌计数计算生存率的药敏方法中没有表现出差异(图9)。

注： *P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001。

3 讨 论

由于在普通的培养条件下不表达SigE分子，不利于实验效应的观察。本实验构建表达SigE的重组耻垢分枝杆菌的实验菌株和空质粒重组耻垢分枝杆菌的对照菌株，以便突显SigE分子的效应。在研究SigE对抗结核药物的敏感性检测中采用刃天青微量滴定板和菌落计数计算存活率两种方法来进行药敏试验。刃天青是一种氧化还原指示剂，活性细菌可将其还原，染料由深蓝色变为粉红色[9]，粉红色的刃天青能够产生很高的荧光信号，无活性的细菌因无代谢能力，所以不具有还原性，不被还原的深蓝色刃天青不能产生荧光信号，基于这样的原理，用酶标仪记录 535Ex/590Em荧光值可以用于检测活性细菌[5]。刃天青微量滴定板法操作简便、快速、成本低廉和结果准确[10]。结果显示INH、RIF、EMB 3种不同药物浓度作用后两种方法结果一致，SigE表达菌比空质粒对照菌相对荧光值高，同时细菌生存率高，即细菌对药物表现出更强的耐受性；氟喹诺酮类的LVFX、CPFX 2个二线抗结核药物表现出SigE表达菌比对照菌相对荧光值高，然而菌落计数计算生存率的药敏方法没有显示出具有统计学意义的差异。两种方法不一致的具体原因还不明确，我们分析首先可能是两种方法存在差异，前一种我们评估细菌的活力(在液体培养氧化的能力)，而在后一种评估的活细菌的数量；再者，细菌暴露于各种压力条件下可能产生具有不同培养要求[11]和生物化学特性[8]的异质分枝杆菌种群。

根据已有的研究结果，潜伏在肉芽肿细胞或巨噬细胞内的结核分枝杆菌SigE高表达，这提示SigE与结核分枝杆菌的潜伏和持留密切相关[12]。当结核分枝杆菌在体外缺氧或饥饿条件下的研究表明，会启动SigE的转录表达，促使结核分枝杆菌可以进入非复制持留状态[13]。因此，我们推测SigE是否通过促进细菌持留而使细菌的敏感性降低。实际上，结核分枝杆菌处于非复制的持留状态对药物的失去敏感性已被广泛关注，预防或阻止分枝杆菌进入非复制的持留状态成为研究的新型治疗策略和靶点[14]。由于结核分枝杆菌复苏促进因子(Rpf)可以促进非复制的持留菌复苏生长[15]，我们构建了重组的有活性RpfE因子来观察SigE诱导持留菌形成的情况。在抗生素处理后的SigE表达菌在含RpfE因子的培养基中观察到最大可能数MPN包括持留菌在内的所有活菌，在不含RpfE因子培养基的菌落CFU则只含活菌不含持留菌，两种之差表现为复苏指数RI反应持留菌的多少。实验采用INH、RIF、EMB、LVFX、CPFX几种抗生素作用于SigE表达菌，观察到INH、EMB两种药处理后SigE重组耻垢分枝杆菌复苏指数是明显高于对照组，而其他几种抗生素的复苏指数与对照组无明显差异。不同抗生素处理出现持留菌不同的结果，我们推测可能与SigE的作用特点和抗生素的作用机制有关。SigE属于胞浆外选择性σ因子家族，该家族因子主要对胞外刺激信号或作用于细胞表面应激信号有关[16]，INH和EMB都是作用于细胞壁合成的抗结核药物[17]。我们研究的结果与Pendzich和Pisu等观察到的结果类似[5]。

近年来耐药结核病不断涌现[18],增加了结核病控制和治疗的难度[19]。通过本实验，我们发现SigE的表达可促进细菌进入持留状态影响INH和EMB作用的敏感性，这可能是影响作用分枝杆菌细胞壁表面成分合成类抗结核药物敏感性的重要原因。虽然耻垢分枝杆菌是结核分枝杆菌的模式菌，但必定不是致病菌，所以有必要后续在结核分枝杆菌中验证SigE是否也有相同的作用。此外,结核分枝杆菌持留涉及的信号通路复杂，且SigE是一个转录调节因子，那么它影响细菌持留的具体通路是怎样的，有待进一步深入研究，有利于抗持留菌新药的开发。

利益冲突：无