响应面法优化紫外线处理后双孢菇中维生素D2皂化工艺

张月，沈雅萍，李利利，王凤玲，关文强

(天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津市食品与生物技术重点实验室，天津，300134)

食用菌，俗称“蘑菇”，是一类可供食用的大型真菌。我国对食用菌的认识利用可以追溯到公元前4000年到公元前3000年的仰韶文化时期[1-2]。食用菌味道鲜美、风味独特，富含蛋白质、多糖、氨基酸等多种营养成分，具有一定的抗肿瘤、降血压等药学功效[3-4]。双孢菇为世界范围内栽培量较大的食用菌之一，因其菇体洁白、风味独特受到消费者的广泛欢迎。

近年来，大量实验研究表明，双孢菇中大量的麦角甾醇在紫外线的作用下会转化为VD2[5-11]，对人类健康具有重要价值。VD2为VD家族的重要一员，在人体内主要起调节钙磷代谢平衡的作用。VD的缺乏会导致骨质疏松、软骨病等病症，且与高血压、中风、糖尿病等有重要关系[12-13]。VD主要来自动物性食物，食用菌是极其稀少的天然植物性食物来源[14]，可以预计，未来食用菌中的VD2将成为VD的一个主要来源。因此，食用菌中的VD2调控、分析及应用将拥有广阔的前景。

VD2的提取方法主要分为皂化法[15-19]和非皂化法[20-22]。非皂化法虽然提取时间较短，但提取过程要加入二甲基亚砜等易致毒试剂作为破壁剂，危险系数较大，故未能得到广泛使用。皂化法即将样品加入碱和醇进行皂化反应，使脂类转变成水溶性的皂化产物，释放出其包裹的VD2[23]，然后用有机溶剂提取，反应条件温和，操作简单，成为VD2的主要提取方法。VD2的皂化工艺影响着食用菌中VD2的准确定量，因而建立可靠可行的皂化工艺尤为重要。

响应面法是一种最为常用统计学方法，利用有限次试验得到数据来建立因素与响应值之间的函数模型，由部分推断整体，从而获得最佳工艺条件[24-26]。目前为止，尚未有利用响应面法优化食用菌中VD2皂化工艺的研究报道。本文以紫外线处理后的双孢菇为实验材料，通过单因素实验及响应面实验优化VD2的皂化工艺，为食用菌中VD2的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

VD2(50-14-6)，美国ChemService公司；双孢菇，天津市闽中食用菌种植基地；甲醇(色谱纯)天津市光复科技发展有限公司；无水乙醇、正己烷，分析纯天津市风船化学试剂科技有限公司；实验室用水为超纯水。

LC-10ATVP高效液相色谱仪，日本岛津；Milli-Q水纯化系统，美国Millipore公司；短波紫外照射装置，天津天商冰源科技发展有限公司；短波紫外灯管天津瑞森特紫外线设备有限公司；UVX-25 紫外照度计，美国UVP公司；FD-2真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；RE-52A 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 双孢菇紫外线处理

选择品质较好、大小均一的双孢菇均匀置于紫外灯(波长254 nm)下，先将菌盖垂直向上，照射200 s，然后手动翻转，菌柄照射相同时间，照射距离20 cm，照射强度1 000 μW/cm2，计算得照射剂量为每面2.0 kJ/m2。照射完成后，将双孢菇置于-80 ℃冰箱冷冻48 h后放入真空冷冻干燥机内，真空度约为10 Pa，冷阱温度为-80 ℃，干燥时间为60 h。将干燥后的双孢菇研磨成粉，置于-80 ℃超低温冰箱中保存待用。

1.2.2 VD2皂化提取工艺

准确称取双孢菇粉末1.00 g，加入4 mL抗坏血酸钠溶液(1 mol/L)作为保护剂，无水乙醇和氢氧化钾(50%)作为皂化碱液，混合物水浴皂化后冷却至室温。将上清液加入15 mL去离子水、15 mL乙醇，用25 mL正己烷提取3次，合并有机相。去离子水洗至中性。有机相旋蒸至干，残渣用2 mL甲醇溶解，过0.45 μm尼龙膜，使用高效液相色谱测定VD2含量。

1.2.3 液相色谱分析条件

色谱柱：SinoChrom OD-BP(4.6×200 mm 5 μm)；流动相：甲醇-水；流动相比例：V(甲醇)∶V(水)=90∶10；流速： 1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：264 nm；进样量：10 μL。

1.2.4 标准曲线的绘制

避光条件下准确称取VD2标准品10 mg，甲醇溶液溶解并定容于棕色容量瓶100 mL，该储备液浓度为100 μg/mL，-20 ℃下避光密封保存。准确吸取标准储备液0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀。配制成浓度为1、5、10、20、40 μg/mL的标准系列工作液，上液相色谱测定，得到峰面积(y)和浓度(x)的线性回归方程。

1.2.5 单因素实验设计

1.2.5.1 醇碱体积比

避光称取双孢菇粉末1.00 g，设置无水乙醇和氢氧化钾(50%)的体积比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，液固比12∶1(mL∶g)，皂化时间60 min，皂化温度70 ℃的条件下进行VD2的提取，考察醇碱体积比对双孢菇中VD2提取量的影响。每个处理设置3组平行实验。

1.2.5.2 液固比

避光称取双孢菇粉末1.00 g，设置液固比(mL∶g)为3∶1、6∶1、12∶1、18∶1、24∶1，在醇碱体积比为2∶1，皂化时间60 min，皂化温度70 ℃的条件下进行VD2的提取，考察皂化碱液体积对双孢菇中VD2提取量的影响。每个处理设置3组平行实验。

1.2.5.3 皂化温度

避光称取双孢菇粉末1.00 g，设置皂化温度为50、60、70、80、90 ℃，在醇碱体积比为2∶1，液固比为12∶1(mL∶g)，皂化时间为60 min的条件下进行VD2的提取，考察皂化温度对双孢菇中VD2提取量的影响。每个处理设置3组平行实验。

1.2.5.4 皂化时间

避光称取双孢菇粉末1.00 g，设置皂化时间为20、40、60、80、100 min，在醇碱体积比为2∶1，液固比为12∶1(mL∶g)，皂化温度为70 ℃的条件下进行VD2的提取，考察皂化时间对双孢菇中VD2提取量的影响。每个处理设置3组平行实验。

1.2.6 响应面实验设计

根据单因素实验优化结果，固定醇碱体积比为2∶1，选择液固比(X1)、皂化温度(X2)、皂化时间(X3)为考察因素，以VD2的提取量为响应值(Y，μg/g)，利用Design-Expert软件设计3因素3水平的响应面实验，如表1。

2 结果与分析

2.1 VD2标准曲线与色谱图

VD2标准品及双孢菇样品色谱图如图1、图2所示，根据标准品保留时间定性，峰面积定量。VD2质量浓度(x)和峰面积(y)之间的线性回归方程为y=30 702x-1 809.2，R2>0.999，线性范围1.0～40.0 μg/mL，VD2浓度和峰面积之间有良好的线性关系。

图1 VD2标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of VD2

图2 双孢菇样品色谱图Fig.2 Chromatogram of white button mushroom sample

2.2 单因素实验结果分析

2.2.1 醇碱体积比

如图3所示，当醇碱体积比从1∶1增加到2∶1后，VD2提取量有大幅度的增加，无水乙醇的增加使物料与皂化液混合更均匀。继续增加醇碱体积比，VD2提取量略有减少并趋于稳定，过量无水乙醇的加入降低了KOH溶液的浓度，减少了VD2提取量，并增加了成本，故醇碱的体积比选择2∶1。

图3 醇碱体积比对VD2提取量的影响Fig.3 Effect of alcohol-alkali ratio on the extraction of VD2注：不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。

2.2.2 液固比

由图4可以看出，液固比(mL∶g)在3∶1～12∶1，VD2提取量随液固比的增加出现较大幅度的增加，液固比为12∶1(mL∶g)时，VD2提取量达到最大值，之后再增加液固比，对VD2提取量影响不大，曲线保持平稳趋势。

图4 液固比对VD2提取量的影响Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction of VD2

碱液的增加使物料皂化更充分，但后续过程需要大量的水洗去残留碱液，对VD2造成一定的损失，综合考虑，液固比选择12∶1(mL∶g)。

2.2.3 皂化温度

如图5所示，随着温度的升高，VD2提取量先增加后减少。皂化反应为吸热反应，温度的升高加快了反应速率，增加了VD2提取量，但当温度超过70 ℃时，由于高温破坏了VD2结构，导致提取量减少，故皂化温度选择70 ℃。

图5 皂化温度对VD2提取量的影响Fig.5 Effect of saponification temperature on the extraction of VD2

2.2.4 皂化时间

由图6可知，皂化时间在20～60 min，皂化时间对VD2提取量影响程度较大，皂化时间的延长使皂化反应更加完全，当皂化时间达到60 min时，VD2的提取量达到最大值。继续延长皂化时间，VD2提取量趋于稳定，故皂化时间选择60 min。

图6 皂化时间对VD2提取量的影响Fig.6 Effect of saponification time on the extraction of VD2

2.3 响应面实验结果分析

基于单因素实验结果，以液固比(X1)、皂化温度(X2)、皂化时间(X3)为自变量，VD2提取量(Y)为响应值，对双孢菇中VD2皂化反应工艺进行响应面实验优化，结果见表2。

2.3.1 模拟方程的建立及显著性检验

利用统计软件Design-Expert软件对表2的实验结果进行多元回归拟合，得到3个自变量与提取量之间的二次多项回归方程：

表2 皂化反应工艺响应面实验设计及结果Table 2 Experimental results of response surface analysis for optimizing the saponification of VD2

对回归模型进行方差分析以检验其显著性，如表3所示。

表3 回归方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

注：*表示差异显著，P<0.05,**表示差异极显著，P<0.01。

各因素的显著性检验结果表明所选择的3个因素对VD2皂化反应的影响程度：皂化温度(X2)>液固比(X1)>皂化时间(X3)。3个因素的二次项对VD2皂化反应的影响均为显著，X1X2对VD2皂化反应影响效果较显著，X1X3、X2X3对VD2皂化反应影响效果不显著。

2.3.2 响应面分析影响因素的交互作用

3因素交互作用的响应面和等高线图如图7所示，由图7可以直观地看出因素间两两交互作用对响应值的影响。液固比和皂化温度的交互作用对VD2的提取量影响较显著，表现为响应面坡度较陡、等高线椭圆明显。液固比和皂化时间的交互作用对VD2的提取量影响程度次之，皂化温度和皂化时间的交互作用对VD2提取量的影响不显著，表现为响应面曲面较为平滑。

图7 各因素交互作用对VD2提取量影响的响应面和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of various factors on the extraction of VD2

通过响应面实验分析得到的VD2最佳皂化工艺参数为液固比为12.36∶1(mL∶g)、皂化温度为74.7 ℃、皂化时间为62.6 min，此条件下，VD2的理论提取量为8.25 μg/g。 为检验该模型所得最佳工艺参数的可行性，采用上述工艺参数进行验证实验，考虑到实际操作，调整最佳工艺为液固比为12∶1(mL∶g)、皂化温度为75 ℃、皂化时间为63 min，3组平行实验得到VD2的平均提取量为8.13 μg/g，与理论值误差较小，证明响应面实验所得皂化工艺条件可信可行。

3 结论

由季节、地理、饮食习惯等原因导致的VD缺乏情况在世界范围内较为普遍[14]，不同人群的VD的每日参考摄入量范围为15～20 μg[16，27]，以本文的量来计算，大约25 g紫外线处理后的新鲜食用菌即可满足需求。

以紫外线处理后的双孢菇为实验材料，结合单因素实验结果，对VD2的皂化工艺进行了响应面实验，优化得到的最佳工艺参数为液固比为12∶1(mL∶g)、皂化温度为75 ℃、皂化时间为63 min，验证实验得到VD2的平均提取量为8.13 μg/g，与理论值偏差较小，说明响应面法分析得到的最佳工艺参数合理可行，为食用菌中VD2的精准分析提供参考，从而最终为富含VD2的食用菌产品开发利用提供参考。