辣椒疫霉效应分子RxLR19781与其互作蛋白的酵母互作一对一验证

陈姗姗,艾聪聪,盛慧,孙柏华,冯锐,王中洋,黄恺浩,王晓梅*

辣椒疫霉效应分子RxLR19781与其互作蛋白的酵母互作一对一验证

陈姗姗1,艾聪聪2,盛慧2,孙柏华2,冯锐2,王中洋2,黄恺浩2,王晓梅1*

1. 吉林农业大学农学院, 吉林 长春 130118 2. 山东农业大学植物保护学院;山东省蔬菜病虫生物学省级重点实验室, 山东 泰安 271018

辣椒疫霉菌（）引起的辣椒疫病是毁灭性土传病害，短期内暴发成灾，该病害严重发生常给辣椒生产造成严重损失。植物病原卵菌分泌大量的胞内效应分子，即RxLR效应分子，能干扰寄主植物细胞的正常生理代谢和功能，在病原卵菌侵染寄主及与寄主植物互作过程发挥着重要的作用。酵母双杂交（Yeast two hybrid, Y2H）系统是研究蛋白质相互作用最常用的方法，它既可以在cDNA文库中筛选互作的未知靶标蛋白，同时还可以验证两个目的蛋白之间的互作关系。本研究分别以辣椒疫霉cDNA基因组，辣椒cDNA基因组为模板，克隆了辣椒疫霉效应因子RxLR19781以及其疑似互作蛋白泛素连接酶E2 10和辣椒脂质转移蛋白EARLI 1，并将它们分别成功构建到PGBKT7和PGADT7载体上。运用酵母共转化技术，将带有AD载体的互作蛋白和带有BD载体的效应因子共同转化到酵母感受态Y2HGold中，对它们是否存在互作关系进行了深入研究。结果表明，两个疑似互作蛋白都与效应因子RxLR19781互作。但由于酵母双杂交存在一定的假阳性，因此该效应分子与互作蛋白的互作有待进一步深入的研究。

辣椒疫霉菌; RXLR效应分子; 酵母双杂交

辣椒疫霉菌()引起的辣椒疫病是在世界范围内广泛分布的毁灭性病害之一[1]，其寄主范围广，引起的作物疫病是作物生产上的灾难病害，造成巨大的经济损失[2]，因此具有重要的经济学与生态学的意义[3]。疫霉菌分泌大量的效应分子，一类为胞间效应分子，一类为胞内效应分子[4]其中RxLR效应分子是一类胞内效应分子吗，其能干扰寄主植物细胞的正常生理代谢和功能。RxLR效应分子分为两个功能区：N端区包括信号肽和RxLR-dEER，其中约为20个氨基酸长短的信号肽可引导效应蛋白进入真核细胞[5]，RxLR和相关的dEER（Asp-Glu-Glu-Arg；前导Asp可变）基因以某种方式穿过宿主质膜将病原效应蛋白传送至宿主细胞[6,7]。C端区是效应因子功能域，将效应蛋白定位于胞内靶标位点而发挥其生物学功能[8]。通常有W、Y、L、K保守域，其中W域主要与抑制植物细胞死亡有关[9]。基因组测序表明辣椒疫霉含350个候选RxLR效应分子[5]，而且这些效应分子与寄主的互作符合基因对基因假说[10]，利用辣椒的抗病基因是防控辣椒疫病最有效的措施。因此研究辣椒疫霉效应因子与寄主靶标蛋白分子水平的互作机制是揭示其致病机理及寄主抗病机理的重要途径。

酵母双杂系统(Yeast two-hybrid system, Y2H)是一种利用单细胞真核生物酵母在体内分析蛋白质-蛋白质相互作用的系统[11]，是研究蛋白质相互作用最常用的方法[12]。真核细胞基因转录起始需要转录激活因子的参与，转录激活因子通常有两个或两个以上相互独立的结构域构成，即DNA结合结构域(DNA binding domain, BD)和转录激活域(Activation domain, AD)。通常融合在含有BD结构域载体上的基因称为“诱饵蛋白”，融合在含有AD结构域的基因称为“猎物蛋白”，如果两个蛋白能够直接相互作用，会使两个结构域在空间位置上相互靠近，形成一个完整的转录激活因子，并激活酵母细胞内的相应报告基因，使报告基因表达；反之，如果两个蛋白没有发生直接的相互作用，报告基因的则不会被激活转录[13]。通过将携带诱饵蛋白的BD载体和携带猎物蛋白的AD载体共同转化到Y2HGold菌株中，然后利用选择培养基进行筛选，检测Y2HGold菌株中4个报告基因（AUR1-C、HIS3、ADE2、MEL1）的表达来分析蛋白之间的相互作用。

虽然酵母双杂交技术具有筛选效率高、可直接在核酸水平操作、接近植物细胞条件所编码的外源蛋白能够保持正确折叠方式等优点，但依然存在其局限性：酵母双杂是基于转录的体系，能自发激活报告基因的诱饵蛋白不适合做筛选；酵母双杂筛选分离不到经过翻译后修饰才具有蛋白质结合活性的蛋白质；如果相互作用有其他非肽类成分的参与，则蛋白质之间的相互作用就无法检测到；相互作用可能缺少生物学上的微环境，很多蛋白质相互作用只发生在特定的生理环境下。因此蛋白质间的相互作用还需其他方法加以验证提高其可靠性。

本研究运用酵母共转化技术，对辣椒疫霉效应因子RxLR19781以及其疑似互作蛋白泛素连接酶和辣椒脂质转移蛋白是否存在互作关系进行了深入研究。之前得到研究表明效应因子RxLR19781在植物抗病途径中发挥重要作用，因此具有研究价值。本研究结果表明，两个疑似互作蛋白都与效应因子RxLR19781互作。此研究为后续验证互作提供了理论可能性，为揭示辣椒疫霉抗病机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源

辣椒疫霉菌株SD33由本实验室分离鉴定，辣椒为本实验室种植的自交系06221, YPDA、SD/-Leu/-Trp、SD/-His/-Leu/-Trp、SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp、X-α-gal、AbA、酵母转化试剂盒、鲑鱼精DNA均购自Clontech公司。

1.2 载体与感受态

本研究所用载体包括：PGADT7，PGBKT7购自Clontech公司。感受态细胞酵母Y2HGold感受态自制。

1.3 辣椒疫霉效应分子RxLR19781及其疑似互作蛋白的克隆与载体构建

以辣椒疫霉SD33基因组DNA为模板，根据载体图谱选择双酶切位点，效应因子RxLR191的酶切位点分别选择NdeI和Cla I，根据酶切位点设计引物进行PCR反应，克隆带有酶切位点的RxLR19781片段，设计引物如下F：CATATGCTGTCGACACAAGCTGACGC，R：‐ATCGATAGGAAGTCCTTTCTTGTTAA。反应体系5.0µL10×PCR buffer (Mg2+plus)，4.0µLdNTP，1.0µLForward Primer (10µmol/L)，1.0µLReverse Primer (10µmol/L)，2.0µLDNA，0.5µLTaq聚合酶，36.5µL dd H2O，共50µL体系；反应程序为：94℃预变性2~5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸20 s，共反应30个循环，72℃总延伸5min，PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，回收目的条带，胶回收步骤按照Bio Teke Corporation多功能DNA纯化回收试剂盒中说明书操作。将回收产物与载体质粒分别用Nde I和Cla I进行双酶切，37℃酶切2h。酶切体系为：dd H2O 24µL，10×buffer 2µL, DNA 10µL，Kpn I内切酶2μL，Bam H I内切酶2µL。回收酶切产物，连接目的基因与载体，16℃4~6h，连接体系为：载体8µL，目的基因2µL，Solution I10µL。连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态中，用Kana进行抗性筛选并进行PCR验证，测序正确后提取质粒。

同理，以辣椒基因组为模板，克隆并构建疑似互作蛋白泛素连接酶和辣椒脂质转移蛋白的载体。设计泛素连接酶引物如下：F：CGGAATTCATGGCGAAGCCAATTG，R：CGGGATCCTTACTTCATCTTTTTCCGGACTTC。设计辣椒脂质转移蛋白引物如下：F：CGGGATCCATGGCTTCCAAGAAAACTAC，R：CCCTCGAGATTAGGACATTGAAAGCCAG。再根据构建效应分子载体的步骤，直到测序正确提取质粒。

1.4 酵母感受态的制备

将Y2HGold酵母菌株在YPDA固体培养基上划线活化，30℃培养2~3 d，挑取2~3mm大小的单菌落到3 mL YPDA液体培养基中（Kana），30℃，250rpm过夜摇菌至菌液浑浊；向50mL YPDA（Kana）液体培养基中加入5µL过夜培养的酵母菌液，30℃，250rpm摇到OD600值在0.15~0.3左右；3500 rpm离心5 min，弃上清，再用100mL YPDA（Kana）培养基重悬菌体，并继续30℃，250rpm摇菌培养至OD600=0.5左右；25℃，3500rpm离心5min，倒掉上清，用20mL灭菌后的超纯水重悬菌体并离心3500rpm，5min；弃上清，用1.5mL的1.1×TE/LiAc重悬菌体，分装到两个1.5mL的PE离心管中，14000rpm，离心15 s，弃上清液；向每个离心管中加600µL的1.1×TE/LiAc重悬，感受态即制好。

1.5 酵母共转化互作验证

将诱饵载体BD（RxLR19781BD）与猎物载体AD用共转化的方法转入到酵母菌株Y2HGold中，具体步骤如下，（1）加入构建好的重组BD质粒g与AD质粒100ng~500ng，加入5µL的变性鲑鱼精（10mg/mL），加入50~70µL感受态细胞，轻弹混匀，加入PEG/LiAc 500µL，轻弹混匀；（2）放到30℃水浴孵育30min，每10min轻轻颠倒混匀1次；（3）30℃孵育结束后加入20µL的DMSO，用移液器轻轻吸打混匀；（4）42℃水浴15min，每5min温和颠倒混匀1次；（5）高速离心15 s，通常选择140000 rpm，离心15 s，用移液器吸尽上清液，慢慢吸走，避免将沉淀的菌液重悬起来；（6）加入1 mL的YPD Plus，重悬菌体，30 ℃，250 rpm，震荡孵育45~60 min；（7）高速离心140000 rpm，15 s，移液器吸尽上清液，避免吸起沉淀的菌体；（8）用0.9%的NaCl重悬菌体，取适量的重悬液涂布在SD/-Trp/-Leu，SD/-Trp/-Leu /-His和SD/-Ade/-His /-Trp/-Leu平板上，30 ℃，倒置培养3~4 d。在SD/-Trp/-Leu培养基上长出单菌落之后，挑取单菌落分别点斑于SD/-His /-Trp/-Leu和SD/-Ade /-His/ -Trp/-Leu /+ X-a-gal固体培养基上，30 ℃暗培养7~10 d，记录观察结果。

2 结果与分析

2.1 辣椒疫霉效应因子RxLR19781的克隆及载体的构建

以辣椒疫霉cDNA为模板，以RxLR19781-BD-F、RxLR19781-BD-R为引物，扩增片段，成功构建RxLR19781-BD诱饵载体。

2.2 辣椒疫霉效应因子RxLR19781的疑似互作蛋白泛素连接酶E2 10的克隆及载体的构建

以辣椒cDNA为模板，以E2-10-AD-F，E2-10-AD-R为引物，克隆疑似互作蛋白泛素连接酶E2 10全长序列，并成功构建至PGADT7猎物载体。

图 1 RxLR19781基因PCR扩增结果

图 2 E2-10疑似互作蛋白PCR扩增结果

2.3 辣椒疫霉效应因子RxLR19781的疑似互作蛋白辣椒脂质转移蛋白EARLI 1的克隆及载体的构建

以辣椒cDNA为模板，以EARLI 1-AD-F，EARLI 1-AD-R为引物，克隆疑似互作蛋白辣椒脂质转移蛋白EARLI 1全长序列，并成功构建至PGADT7猎物载体。

图 3 EARLI 1疑似互作蛋白PCR扩增结果

2.4 RxLR19781与互作蛋白泛素连接酶E2 10全长共转化互作验证

将RxLR19781-BD与E2 10-AD共同转入酵母菌株Y2HGold验证互作关系。RxLR19781-BD与E2 10-AD共转化后均在加入X-a-gal的SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu平板上变蓝，表明E2 10与RxLR19781存在互作关系。

图 4 Y2H验证RxLR19781与E2 10互作

2.5 RxLR19781与互作蛋白辣椒脂质转移蛋白EARLI 1全长共转化互作验证

将RxLR19781-BD与EARLI 1-AD共同转入酵母菌株Y2HGold验证互作关系。RxLR19781-BD与EARLI 1-AD共转化后均在加入X-a-gal的SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu平板上变蓝，表明EARLI 1与RxLR19781存在互作关系。

图 5 Y2H验证RxLR19781与EARLI 1互作

3 结 论

本研究将酵母双杂交初步筛选出的疑似互作蛋白E210和EARLI 1，经过酵母双杂交一对一验证，初步验证了它们与效应因子RxLR19781存在互作关系。目前已知效应分子RxLR19781能够在植物抗病途径中起作用，但具体是如何与互作蛋白协同发挥作用还未知，且酵母双杂交存在一定的假阳性，因此通过酵母双杂交一对一验证得到的互作蛋白，为后期的CO-IP、Poll-Down实验提供了基础前提，为揭示辣椒疫霉效应因子的抗病机理提供了理论依据，同时也为防治辣椒疫霉做出理论基础贡献。

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One-to-one Verification of the Interaction between theEffector Molecule RxLR19781 and Its Interacting Protein

CHEN Shan-shan1, AI Cong-cong2, SHENG Hui2, SUN Bai-hua2, FENG Rui2, WANG Zhong-yang2, HUANG Kai-hao2, WANG Xiao-mei1*

1.130118,2.271018,

Capsicum blight caused byis a devastating soil-borne disease, which is a disaster in a short period of time. The serious occurrence of this disease often causes serious losses to pepper production. Plant pathogenic oocysts secrete a large number of intracellular effector molecules, namely RxLR effector molecules, which can interfere with the normal physiological metabolism and function of host plant cells, and play an important role in the process of infecting host and host plants with pathogenic oomycetes. The yeast two-hybrid (Y2H) system is the most commonly used method for studying protein interactions. It can not only screen for unknown target proteins in cDNA libraries; but also verify the interaction between two proteins of interest. The Phytophthora cDNA genome and the capsicum cDNA genome were used as templates to clone theeffect factor RxLR19781 and its suspected interacting protein ubiquitin ligase E210 and capsicum lipid transfer protein EARLI 1. They were successfully constructed on the PGBKT7 and PGADT7 vectors, respectively. Using yeast co-transformation technology, the interaction protein with AD vector and the effector factor with BD vector were transformed into yeast competent Y2HGold, and their interaction relationship was studied. The results showed that both suspected interaction proteins interacted with the effector RxLR19781. However, due to the existence of certain false positives in yeast two-hybrid, the interaction between the effector molecule and the interacting protein is required to further study out。

; RXLR effector; yeast two-hybrid

S436.418.1+2

A

1000-2324(2019)01-0044-05

10.3969/j.issn.1000-2324.2019.01.009

2018-05-12

2018-06-21

国家大宗蔬菜产业技术体系(CARS-25-03B)

陈姗姗(1994-),女,在读硕士研究生.研究方向:植物病原卵菌分子遗传学. E-mail:572120560@qq.com

Author for correspondence. E-mail:wxm820@126.com