川芎嗪干预庆大霉素耳毒性作用的机理研究

王晨露 王永华 王一鸣 郑华平 李文靖

氨基糖苷类药物(aminoglycoside antibiotics，AmAn)是目前临床上治疗革兰阴性杆菌和结核杆菌感染的一种药物，该药物因其性质稳定、杀菌力强、价格低廉等优点为临床常用药。然而氨基糖苷类药物的肾毒性、耳毒性使其在临床应用中受到限制[1]。因此对氨基糖苷类药物引起的耳毒性损失进行积极的防治，及早干预颇为重要。川芎嗪是川芎的重要成分，化学结构为四甲苦吡嗪。现代药理学认为川芎嗪具有抗自由基、改善微循环、保护血管内皮细胞等作用，能够通过血-迷路屏障进入耳蜗外淋巴液，直接作用于耳蜗和听神经，从而发挥改善内耳微循环的功效[2]。川芎嗪防治庆大霉素药物耳毒性作用机理的研究，近年来取得不少进展，阐述机理的学说很多但其机制仍不十分明确。本研究在建立庆大霉素药物性耳聋动物模型的基础上观察致聋耳蜗各细胞的凋亡情况，检测JNK的mRNA表达情况。试图通过本研究，从病理层面及基因水平上，探讨川芎嗪干预庆大霉素耳毒性作用的防治机理。

1 材料与方法

1.1 动物选择及实验分组

健康活泼、无耳疾、耳廓反射灵敏的白毛红目豚鼠36只，雌雄各半，体重260～310 g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。随机分成3组：生理盐水组（Ⅰ组）12只，庆大霉素造模组（Ⅱ组）12只，川芎嗪防治组（Ⅲ组）12只。

1.2 主要药品与试剂

硫酸庆大霉素注射剂：浙江瑞新药业股份有限公司，批号：20111215，规格：8万单位/支；注射用盐酸川芎嗪：哈尔滨三联药业有限公司，批号：110505A2，规格40 mg/支；细胞凋亡试剂盒（Roche公司）；β-Actin： Boster公司，批号：BM0627。

1.3 主要仪器

NGT-Ⅱ型脑干诱发电位仪：中国科技大学生物技术有限公司；荧光显微镜（OLYMPUS BX60型）：olympus公司；HPIAS-1000病理图文分析系统：中国武汉同济千屏影像工程公司；MICROW HM34OE石蜡切片机：德国；台式高速冷冻离心机5417R：德国Eppendorf公司；定量PCR仪器：ABI 7500。

1.4 给药方法

36只豚鼠随机分为3组，即生理盐水组（Ⅰ组）、庆大霉素造模组（Ⅱ组）、川芎嗪防治组（Ⅲ组）。Ⅰ组（12只）肌注与庆大霉素等量的生理盐水，连续12天；Ⅱ组(12只)肌注硫酸庆大霉素120 mg·kg-1·d-1，连续12天；Ⅲ组(12只)肌注硫酸庆大霉素120 mg·kg-1·d-1及腹腔注射盐酸川芎嗪30 mg·kg-1·d-1，连续12天[3]。

2 观测指标

2.1 听性脑干反应（ABR）测试

动物麻醉后，在声电屏蔽室内采用NGT-Ⅱ型脑干诱发电位仪进行测试。电极放置：记录电极置颅顶正中，参考电极及接地电极分置于给声耳及对侧耳后皮下。各电极除针尖部留出10 mm刺入皮下，余均外套硅胶绝缘套。刺激参数及测试参量：刺激声为滤波短声(click)，带通滤波100～3000 Hz，叠加512次，扫描时程10 ms，FDH－39型耳机输出，重复率10次/秒，距离豚鼠耳道口0.5 cm。以Ⅲ波为基准确定反应阈[4]。测试时间：动物分别在实验前、处死前进行ABR测试。

2.2 原位凋亡细胞检测-TUNEL法及图像处理

按TUNEL试剂盒说明书对含内耳的豚鼠颞骨组织的石蜡切片进行标记染色，荧光显微镜（OLYMPUS BX 60型）下观察，结果判断：阳性细胞核呈黄色或棕色，阴性细胞核呈蓝色。每次均设立阳性及阴性对照。阳性对照选择恶性淋巴瘤标本；阴性对照TUNEL反应液中不含TdT酶。对每张切片的阳性细胞的着色强度采用HPIAS-1000病理图文分析系统进行测量[5]。每张切片采集螺旋神经节细胞、螺旋器和侧壁（血管阶）3个视野（×200倍）分别测量，经过该系统分析记录该个视野的免疫反应阳性细胞的平均光密度，得出积分光密度值（integral optical density，IOD）并对IOD数值进行整理及统计分析[4]。

2.3 Real-time PCR法检测JNK的mRNA含量

采用Primer 5.0引物设计软件和引物设计原则进行PCR引物的设计，将豚鼠右侧耳蜗标本从-80℃冰箱中取出，液氮研磨，加入预冷过的TRIZOl试剂300 ul混匀，室温放置5 min。加入氯仿0.2 ml，用力振摇，室温放置2～3 min。在4℃最大转速12000 rpm离心15 min，吸取上层水相，移至另一离心管。加入0.5 ml异丙醇，混匀，室温静置10 min。4℃最大转速12000 rpm离心10 min，弃上清液。加入75%预冷乙醇，用乙醇1 ml清洗试管，倒扣吸水纸上，打开排风扇，静止15 min。加入30 ul DEPC水于静置的离心管中，马上进行吹打，吹打时应注意避免产生气泡，得RNA。短暂离心，依次加入：反复5次第一链反应缓冲液2 μl、Oligo dT引物0.5 μl、逆转录酶0.5 μl、总RNA2 μl，采用DEPC水补齐到10 μl。混匀后将混合物放置在37℃中20 min。85℃加热15 s终止反应，冷冻保存。逆转录完毕后得cDNA。94℃ 5 min，再将反应条件变为94℃15 s，60℃45 s，循环扩增40次。60℃检测荧光值。

3 统计学处理

应用SPSS 19.0统计软件对各种数据进行统计分析，两样本比较，计量资料采用独立样本t检验，多个样本间比较，正态分布采用单因素方差分析，P＜0.05为差别有统计意义。

4 结果

4.1 ABR阈值检测

各组click ABR检测结果如表1所示，实验前各组豚鼠click ABR阈值无显著性差异（P＞0.05）。连续用药12天后，各组豚鼠click ABR阈值间的差别有统计学意义。实验后庆大霉素造模组和川芎嗪组的听阈显著性升高，与生理盐水组相比（P＜0.01）；川芎嗪防治组阈值虽有升高，但明显低于庆大霉素造模组，差异有统计学意义(P＜0.01)。

4.2 不同实验组耳蜗各细胞凋亡的影响

4.2.1 螺旋神经节（spiral ganglion cells，SGC）部位Ⅰ组SGC部位未见TUNEL染色阳性细胞。Ⅱ组可见大量蓝紫色阳性细胞。Ⅲ组可见不同程度的染色阳性细胞，与Ⅰ组相比，IOD值差异有极显著性（P＜0.001），提示庆大霉素能诱导豚鼠耳蜗SGC细胞凋亡。与Ⅱ组相比较，Ⅲ组IOD值有显著性差异(P＜0.05)，提示川芎嗪具有拮抗庆大霉素耳损伤的作用。

表1 实验前后各组豚鼠click ABR阈值比较（dB nHL，±s）

表1 实验前后各组豚鼠click ABR阈值比较（dB nHL，±s）

与同组实验前相比，▲P ＜0.0 1；与实验后I 组相比，△P＜0.01；与实验后Ⅱ组相比，*P＜0.01；Ⅱ组豚鼠死亡2只，实验后无法行ABR测试，故剔除

±s）实验前 实验后I组 24 4.23±4.00 5.77±6.07*Ⅱ组 20 4.67±5.50 49.67±22.40▲△Ⅲ组 24 3.86±4.35 32.73±19.07▲△*组别 N(耳) click ABR阈值（dB nHL，

4.2.2 螺旋器部位Ⅰ组螺旋器未见染色阳性细胞。Ⅱ组可见大量阳性细胞，与Ⅰ组比较具有极显著统计学意义(P＜0.001)。Ⅲ组阳性细胞均不同程度增加，与Ⅰ组比较，有明显统计学差异(P＜0.05)，与Ⅱ组比较，具有极显著统计学差异（P＜0.001），提示川芎嗪可以拮抗庆大霉素对耳蜗毛细胞凋亡的影响。

4.2.3 侧壁：Ⅰ组侧壁染色为阴性。Ⅱ组有大量染色阳性细胞，与Ⅰ组比较，差异有极显著性（P＜0.001），Ⅲ组侧壁TUNEL染色均有不同程度的增加，与Ⅰ组比较均有明显统计学差异(P＜0.05)，与Ⅱ组比较，差异具有极显著性（P＜0.001），提示庆大霉素耳毒性影响侧壁血管纹部位，川芎嗪可拮抗庆大霉素带来的耳损伤。详见表2。

4.3 Real-time PCR检测结果

实验后Ⅱ组与Ⅰ组、Ⅲ组相比，JNK/β-actin mRNA表达量明显升高（P＜0.05），但Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组两两之间差值无统计学意义（P＞0.05）。说明川芎嗪可以明显降低JNK通路在mRNA转录水平上的表达。

5 讨论

庆大霉素引起耳蜗损失的机制有很多学说，其中代谢异常、氧化损伤、微循环障碍等最终导致毛细胞凋亡的机制得到多数学者的认可[6，7]。耳蜗是产生活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的代谢组织，在正常情况下线粒体代谢产生的ROS可被机体内部的抗氧化机制清除，但庆大霉素在一定时间范围内随着用药时间的延长，致使耳蜗产生的自由基含量增加，过量的自由基难以被正常的防御机制所清除，作用于生物膜上的多不饱和脂肪酸而诱发脂质过氧化，从而使生物膜完整性被破坏，通透性增加，促使细胞崩解破裂、死亡[8]。本研究基于ROS可通过JNK信号通路调控耳蜗毛细胞凋亡，来补充庆大霉素耳毒性作用的机制。

表2 三组豚鼠耳蜗细胞凋亡TUNEL积分光密度值(IOD)

表3 实验后各组豚鼠耳蜗JNK/β-actin mRNA表达

c-Jun氨基末端激酶信号通路即JNK信号通路是细胞分化、细胞凋亡、应激反应的通路之一，其中JNK促进细胞凋亡的机制：①通过上调促凋亡蛋白的表达而启动死亡受体途径的细胞凋亡[9～11]；②作用于线粒体，激活的caspase-3与凋亡底物结合引起线粒体途径的细胞凋亡[12]。目前已有Ylikoski[13]和Wang[14]等分别报道，应用JNK的抑制剂可显著抑制庆大霉素诱导的离体培养的毛细胞的凋亡，也有研究表明，川芎嗪可通过抑制JNK通路相关蛋白c-fos、c-Jun，p-JNK的表达来降低缺氧/复氧诱导海马祌经细胞的凋亡和坏死[15]。因此本研究通过检测JNK mRNA的转录情况，试图基于此来探讨川芎嗪对庆大霉素耳毒性的干预机制。

本研究利用Real-time PCR法测mRNA转录水平，庆大霉素造模组的JNK/β-actin mRNA表达量明显升高（P＜0.05），但两两组间（生理盐水组、庆大霉素造模组、川芎嗪防治组）差值无统计学意义（P＞0.05）。说明川芎嗪可以明显降低JNK在基因水平上的表达。本研究结果表明川芎嗪虽不能完全拮抗庆大霉素造成的耳损害，但服用川芎嗪防治后各项指标均有所改善，可明显降低庆大霉素导致的JNK转录水平上的高表达，从而有效防治庆大霉素的耳毒性，这可能是川芎嗪发挥防治作用的机制之一。