非酒精性脂肪性肝病的基础研究进展

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)包括非酒精性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相关肝纤维化和肝硬化。NAFLD的发病机制涉及遗传易感、环境、肠道微生物变化以及它们之间复杂的相互作用，通过扰乱体内脂质平衡促进肝细胞内三酰甘油过度积聚，加之“打击”引发肝脏炎性损伤以及星状细胞活化，导致肝纤维化的发生和发展[1]。本文就NAFLD的基础研究进展作一综述。

1 遗传易感和表观遗传

遗传易感因素在NAFLD的发病中起着重要作用。大量研究表明PNPLA3 rs738409和TM6SF2 rs58542926是NAFLD的遗传易感基因。高加索人群MBOAT7 rs626283的多态性与NAFLD密切相关，且独立于PNPLA3 rs738409、GCKR rs1260326和TM6SF2 rs58542926，4种基因位点的多态性组合与19%的高加索肥胖儿童和青少年的脂肪肝相关，而MBOAT7 rs626283可能与西班牙裔和非洲裔美国儿童和青少年的脂肪肝无关[2]。

微RNA(miRNA)是一类重要的表观遗传调节因子。NAFLD患者及模式动物肝脏的miR-132表达水平显著升高，过表达miR-132的转基因小鼠表现为肥胖和重度肝脂肪变。miR-132通过抑制抑癌基因PTEN和去乙酰化酶SIRT1基因，上调固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、脂肪酸合酶(FASN)，导致血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL)/极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL)和肝内三酰甘油明显增加。提示有望通过下调miR-132的表达水平治疗NAFLD[3]。饮食诱导的肥胖小鼠和NASH患者肝脏的miR-378表达水平升高。miR-378直接靶向作用于AMP活化蛋白激酶γ2(AMPKγ2)的编码基因Prkag2，下调AMPK信号，降低Sirtuin1的脱乙酰化酶活性并促进核因子-κB(NF-κB)/肿瘤坏死因子-α(TNF-α)炎性反应通路，从而导致肝脏炎性反应和纤维化[4]。肝X受体α(LXRα)可选择性地激活miR-378转录并抑制过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)共激活因子1β表达，进而减少脂肪酸氧化并促进脂肪生成，诱发肝脂肪变[5]。核呼吸因子1(NRF1)是脂肪酸氧化的关键调节因子，miR-378和NRF1之间存在负反馈回路，一旦这个回路被激活，它就会维持miR-378活化和NRF1的抑制，从而损害脂肪酸氧化并促进肝纤维化[6]。

超保守RNA是一类长链非编码RNA(lncRNA)。uc.372与pri-miR-195/pri-miR-4668结合并抑制miR-195/miR-4668成熟，从而减轻miR-195/miR-4668介导的与脂质合成相关的功能性靶基因的抑制，包括乙酰辅酶A羧化酶(ACC)，脂肪酸合成酶(FAS)，硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)和与脂质摄取相关的基因如CD36，导致肝脏脂质累积[7]。Blnc1是一种lncRNA，其在肥胖NAFLD小鼠肝脏的表达水平显著升高，肝Blnc1特异性失活的小鼠消除了高脂饮食诱导的胰岛素抵抗、肝脂肪变及NASH，研究显示Blnc1通过LXR/SREBP-1c途径诱导肝脏脂肪变[8]。

角鲨烯环氧化酶(SQLE)是人体胆固醇合成的关键酶。RNA测序分析显示人类NAFLD相关肝细胞癌(HCC)标本中SQLE基因表达异常升高。小鼠肝细胞特异性表达SQLE会促进肝细胞胆固醇堆积和氧化应激水平升高，氧化应激水平升高可诱导DNA甲基转移酶3A表达，后者通过甲基化介导PTEN表观遗传沉默，以及Akt/mTOR信号通路的激活，促进HCC发生和发展。SQLE抑制剂(特比萘芬)可能是防治NAFLD相关HCC的有效药物[9]。

2 肠道菌群及其代谢产物

肠道菌群及其代谢产物的变化也参与NAFLD发病。NAFLD患者的肠道微生物基因丰度下降，导致芳香族氨基酸和支链氨基酸代谢失调。肠道微生物分解芳香氨基酸产生的苯乙酸(PAA)增加与肝脂肪变程度密切相关。NAFLD患者的粪菌移植或长期饲喂PAA可诱发小鼠脂肪肝[10]。在肝内，肠道菌群代谢产物色氨(TA)、吲哚-3-乙酸盐(I3A)可以减少脂肪酸和脂多糖(LPS)刺激的巨噬细胞中促炎细胞因子的产生。I3A依赖于芳烃受体激活，可负性调控FASN和SREBP-1c，减少脂肪生成。高脂饮食喂养的小鼠因肠道菌群改变引起TA和I3A缺失，导致肝脏脂肪累积、炎性反应进展[11]。丁酸钠诱导PPARα刺激脂肪酸β氧化，并可抑制NF-κB介导的炎性反应，从而改善高脂饮食诱导的NAFLD[12]。

磁共振肝脏弹性值较高的NASH患者的3-(4-羟基苯基)乳酸水平是较低者的1.78倍，肝脏活组织检查显示进展期纤维化的NASH患者的3-(4-羟基苯基)乳酸水平是无进展期肝纤维化的NASH患者的1.26倍，提示NAFLD患者肠道菌群代谢产物3-(4-羟基苯基)乳酸与肝纤维化显著相关，而3-(4-羟基苯基)乳酸水平与肠道厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门丰度有关[13]。NAFLD患者粪便菌群丰度的研究显示，NAFLD相关肝硬化患者的肠杆菌科和链球菌增加，而阿克曼菌减少；NAFLD相关HCC患者的拟杆菌和瘤胃菌增加，而双歧杆菌减少[14]。因此，肠道菌群与NAFLD进展期肝纤维化和肝硬化密切相关。

给予肥胖的NAFLD患者短期增加蛋白质含量的等热量低碳水化合物的饮食干预，患者肠道菌群组成发生明显改变，表现为产叶酸菌增多以及肠道吸收叶酸能力增强，肝脏脂肪含量及心血管危险因素改善，因此肠道菌群也是治疗NAFLD的潜在靶点[15]。

3 代谢与激素

除了饱和脂肪酸外，西方人群的NAFLD有些是由富含碳水化合物的膳食后脂质从头合成(DNL)增加所致[16]。分别以饱和脂肪酸(SAT)、不饱和脂肪酸(UNSAT)、单糖(CARB)的形式连续3周给予肥胖者额外1 000 kcal/d的能量，结果肝内三酰甘油分别增加了55%、15%和33%。在增加肝脏脂肪合成的同时，SAT增加脂肪组织分解，UNSAT减少脂肪组织分解，CARB所致的肝内三酰甘油增加中98%是由DNL引起的。SAT还可提高多种血浆神经酰胺水平，这增加了心血管疾病的风险[17]。短期高脂饮食喂养的小鼠以核糖体蛋白S6激酶磷酸化为代表的肝脏合成代谢快速升高，而以转录因子EB介导的基因转录和溶酶体活性为代表的分解代谢作用下调。然而，如果长期高脂饮食喂养，以上两个信号出现相反的动态改变，即表现为合成代谢减慢，而分解代谢加速。营养过剩导致的合成代谢增强期间，机体可通过反馈机制维持分解代谢增强，这对减少肝脏脂质累积非常重要[18]。

NAFLD患者血清初级胆汁酸和次级胆汁酸绝对含量增加，其中次级胆汁酸DCA[法尼酯X受体(FXR)拮抗剂]的相对含量显著增加，而初级胆汁酸CDCA(FXR激动剂)的相对含量显著减少。肝脏的基因表达模式和肠道微生物组成的变化都提示NAFLD患者胆汁酸产生增多，有望通过靶向调控FXR信号介入治疗NAFLD[19]。NASH导致参与氨解毒的鸟氨酸转氨甲酰酶和氨基甲酰磷酸合成酶可逆性降低，导致氨的累积，这可导致瘢痕组织发育，增加肝纤维化进展的风险[20]。

胰岛素通路分为促脂肪生成的经典通路和抗脂肪生成的非经典通路。非经典通路通过Snail1引发的脂肪生成基因表观遗传抑制来平衡经典通路。胰岛素/Snail1通路受损可能导致肥胖者发生NAFLD[21]。除了体质量增加和血糖异常外，雄激素过多也会导致患有多囊卵巢综合征的女性发生NAFLD。调整体质指数(BMI)和血糖后，血清睾酮>3.0 nmol/L与NAFLD发病呈正相关[22]。NAFLD患者的催乳素(PRL)/催乳素受体(PRLR)与NAFLD存在负相关，NAFLD患者的肝脏PRLR基因表达显著降低，且病情越严重下降越明显[23]。

4 信号通路

肥胖及胰岛素抵抗的个体通过不同的信号通路促进肝脏脂肪变、炎性反应和纤维化，同时肝脂肪变和纤维化过程也引起机体不同信号通路的变化，或延缓或促进疾病进展。因此，激活或抑制不同的信号通路可能是治疗NAFLD的新策略。

4.1 上调导致NAFLD进展的通路

高脂饮食诱导的NAFLD可以显著上调肝细胞核受体NR4A1的表达，导致DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)和p53活化。一方面，p53有助于线粒体动态相关蛋白1(Drp1)在线粒体中的迁移，从而驱动线粒体裂变；另一方面，p53抑制促凋亡调节蛋白Bnip3的转录和表达，导致线粒体自噬停滞。过度裂变和缺乏自噬的线粒体介导线粒体功能障碍，包括广泛的线粒体膜通透性转换孔开放、线粒体电位降低、氧化应激、钙超载、线粒体呼吸衰竭和ATP短缺。补充褪黑激素通过阻断NR4A1/DNA-PKcs/p53途径阻止线粒体裂变并恢复线粒体自噬，可以有效减少NAFLD对肝脏线粒体结构和功能的损害[24]。NAFLD患者肝脏Rho激酶1(ROCK1)显著上调，肝脏ROCK1抑制AMPK活性，AMPK下调刺激DNL驱动肥胖诱导的小鼠肝脂肪变。二甲双胍可通过抑制ROCK1，导致AMPK下游信号转导的激活，减少肝脏DNL，从而减轻肝脂肪变程度[25]。NAFLD患者和模式小鼠肝脏肿瘤坏死因子受体相关泛素化支架和信号蛋白(TRUSS)表达升高。肝细胞TRUSS基因敲除可改善高脂饮食喂养的肥胖小鼠的胰岛素抵抗、肝脂肪变、葡萄糖耐受异常和炎性反应。TRUSS与核因子-κB抑制因子α(IκBα)相互作用并促进IκBα泛素化和降解，导致NF-κB异常激活，从而促进病理性刺激诱导的NAFLD和代谢紊乱[26]。缺氧诱导因子(HIF)被证实为免疫和炎性反应的重要调节剂。棕榈酸通过激活巨噬细胞中HIF-1α损伤自噬。NASH小鼠的巨噬细胞和人血单核细胞中存在激活的HIF-1α和受损的自噬。HIF-1α激活和自噬受损，通过上调NF-κB活性刺激巨噬细胞炎性反应[27]。NAFLD患者肝细胞HIF-2α活化，通过上调富含组氨酸的糖蛋白(HRGP)刺激肝脏M1型巨噬细胞极化，并分泌TNF-α、白细胞介素-12(IL-12)、CCL2和CXC趋化因子配体10(CXCL10)等炎性反应趋化因子，促进NASH发生和发展[28]。肥胖患者内脏脂肪组织(VAT)中CD11c表达与VAT表达的中性粒细胞趋化基因和肝脏表达的中性粒细胞和巨噬细胞标记基因相关。在NASH发生过程中，VAT中CD11c+促炎脂肪组织巨噬细胞累积，诱导肝脏巨噬细胞聚集，从而促进炎性反应进展[29]。高脂饮食诱导NAFLD小鼠肝组织中干扰素基因刺激蛋白(STING)水平升高，伴JNK和p65磷酸化，以及TNF、IL-1B和IL-6等巨噬细胞介导的炎性因子表达升高，促进肝脏炎性反应和纤维化[30]。人和小鼠NASH肝脏的内质网(ER)应激诱导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-2(Caspase-2)表达升高，Caspase-2与位点1蛋白酶(S1P)结合，并切割其产生可溶性活性片段，后者在ER中启动SREBP裂解激活蛋白非依赖性SREBP1和SREBP2活化，进而促进肝脂肪变、炎性反应损伤和纤维化[31]。

4.2 上调利于NAFLD改善的通路

双特异性磷酸酶(DUSP)是一类既可使酪氨酸残基脱磷酸，又可使丝氨酸/苏氨酸残基脱磷酸的酶分子。DUSP9在胰岛素敏感组织中表达，可随胰岛素抵抗的存在而改变。DUSP9通过抑制ASK1磷酸化和后续下游JNK/p38信号，预防肝脂肪变和NASH进展，包括肝脏脂质积聚、葡萄糖代谢紊乱、炎性反应增强和肝纤维化，因此DUSP9是高脂饮食诱导的肝脂肪变和炎性反应的关键抑制因子[32]。DUSP14直接结合并去磷酸化转化生长因子β激活激酶1(TAK1)，导致TAK1及其下游信号分子JNK/p38和NF-κB下调，可改善胰岛素抵抗、肝脏脂质积累和伴随的炎性反应[33]。AMPK在控制能量代谢响应生理和营养状态中起关键作用，AMPK可通过makorin环指蛋白1(NKRN1，一种E3泛素连接酶)泛素化而降解。MKRN1缺失小鼠的肝脏和脂肪组织呈现持续的AMPK活化，促进葡萄糖消耗，并抑制肝脏脂质积累[34]。高脂饮食喂养的小鼠的白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4(LILRB4)上调，LILRB4与SHP1直接相互作用并被磷酸化，两者共同抑制TRAF6泛素化激活，并阻断随后的NF-κB与p38的活化，从而逆转胰岛素抵抗、肝脂肪变、炎性反应和代谢紊乱[35]。去泛素化酶通过水解泛素羧基末端的肽键、异肽键或者酯键，将泛素小分子特异性地从靶蛋白或前体蛋白上水解下来，以保护靶蛋白不通过泛素-蛋白酶体途径降解。泛素特异性蛋白酶(USP)是最大的去泛素化酶家族。肝细胞中USP4过表达可显著减轻NAFLD病理改变。肝细胞中USP4直接结合并去泛素化TAK1，并抑制下游NF-κB和JNK级联反应，从而逆转IRS-Akt-GSK3β的破坏，并改善NAFLD。相反，肝细胞中USP4耗竭加剧了高脂饮食诱导的NAFLD小鼠的胰岛素抵抗和脂肪性肝炎[36]。USP10结合SIRT6，并抑制其泛素化和降解，增加的SIRT6可抑制SREBP1、激活LXR和PPARα基因表达，从而改善胰岛素抵抗和脂肪性肝炎[37]。线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)激酶(NADK)催化NAD磷酸化产生烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。NADK基因敲除小鼠具有NAFLD的特征，NADK缺乏导致肝细胞特异性cAMP反应元件结合蛋白(CREB)和PPARα活性下降，进一步促使肝脏脂质代谢紊乱、肝细胞损伤、炎性反应和纤维化[38]。Caspase募集域家族成员6(CARD6)是调节细胞死亡和免疫的CARD家族成员，其与ASK1相互作用并抑制其磷酸化和后续下游JNK/p38信号，从而改善高脂饮食引起的肥胖、胰岛素抵抗和脂肪性肝炎[39]。腺苷A2A受体(A2AR)在内毒素和(或)缺血诱导的组织损伤中发挥保护作用。A2AR全身敲除和骨髓组织特异性敲除小鼠都表现出严重的肝脏脂肪浸润和炎性反应。破坏A2AR导致小鼠肝脏NF-κB和JNK1活化，TNF和IL-1β等炎性因子增加，加重肝脏炎性反应；同时引起SREBP-1c、FASN、ACC1等表达升高与转录活性增强，进而导致肝脏脂肪合成增加[40]。肝脂肪变可以通过ER应激导致代谢紊乱、NLRP3炎性小体激活和细胞死亡。B细胞淋巴瘤2相关X蛋白抑制因子-1(BI-1)具有抑制ER应激的作用。NAFLD患者肝组织中BI-1表达下调，肝内肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)的内切核糖核酸酶信号活化，导致IRE1α、X-框结合蛋白1(XBP1)和CHOP表达上调，活化的IRE1α/XBP1通路导致NLRP3炎性小体和Caspase-1激活，以及SREBP-1c、FASN、IL-1β、IL-6、单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、CXCL1、Toll样受体4(TLR4)、组织金属蛋白酶抑制因子1(TIMP1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)等代谢、炎性反应和纤维化相关基因表达增强[41]。

5 结语

总之，NAFLD在从单纯性肝脂肪变向脂肪性肝炎、肝硬化和HCC的进展过程中，受到遗传和表观遗传、环境因素、膳食、代谢、激素和肠道微生物变化之间复杂相互作用的影响，这些因素通过不同的信号通路来影响NAFLD的进展或康复。加强对关键信号通路调控靶点的研究并开发激活或阻断信号通路的新药，有望为治疗NASH带来新路径。