黑豆皮中原花青素含量测定及抗氧化活性研究

李 勇，李代魁，李忠平，董 川

（山西大学环境科学研究所，山西太原 030006）

0 引言

原花青素（Proanthocyanidins，简称PC） 是重要的一类植物次生代谢产物，最早是从松树皮中提取出来的，随后陆续从葡萄、苹果、山楂、莲蓬、银杏、可可、柳树叶、白桦树等植物的皮、核或种子中发现了原花青素[1]。原花青素是一类自然发生的黄烷醇聚合而成的多酚类物质，按聚合度的大小将二至四聚体统称为低聚体（OPC），将五聚体及其以上的缩合体统称为高聚体（PPC）[2]。在所有类型的原花青素里，二聚体来源最广，对其的研究也最多[3]。原花青素具有丰富的药理活性，根据文献报道[4-8]，PC具有抗菌、抗癌、抗病毒、抗氧化和神经保护的作用。因此，PC在化妆品、营养、医疗保健等领域越来越受到人们的青睐。

我国自古以来就有“大豆数种，唯黑入药”的历史记载，黑豆皮在我国古代中药中具有重要的药用地位[9]。对黑豆皮及子叶中的物质组分进行研究时发现，黑豆皮中的多酚类物质含量较高，特别是花青素和原花青素等化学物质[10-11]。黑豆是一种集食用、保健、药用于一体的豆类品种，但其中的原花青素的提取与测定方法文献报道较少。因此，试验选取黑豆皮为原材料，以乙醇为提取剂，提取和纯化原花青素，并建立原花青素的HPLC分析方法，旨在确定快速、准确、可靠的分离分析黑豆皮中PC的方法，同时为黑豆皮的质量评价提供科学依据，为黑豆皮的深加工工业化生产提供可能性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑豆皮，购于太原市某农贸市场。

原花青素标准品（纯度＞98%），上海哈灵生物科技有限公司提供；乙醇、甲醇、盐酸，均为分析纯；HPLC甲醇为色谱级、ABTS（2'-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸），Aladdin公司提供。

电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司产品；超声波清洗器，天鹏电子新技术有限公司产品；旋转蒸发仪（Heidolph/G3）、紫外-可见分光光度计，珀金埃尔默仪器上海有限公司产品；安捷伦HPLC-1200型高效液相色谱仪。

原花青素对照品见图1。

图1 原花青素对照品

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液配制

准确称取2.00 mg原花青素溶于2.00 mL质量分数1%盐酸甲醇溶液中，配成质量分数1 mg/mL的标准储备液。从标准储备液中吸取一定量，用质量分数1%盐酸水溶液稀释成质量分数5，50，100，250，500 μg/mL标准品待测液，用0.45 μm滤膜过滤，取20 μL上样。

1.2.2 供试品溶液的制备

称取黑豆皮样品各20 g，加入200 mL质量分数1%盐酸乙醇，于室温下超声处理3次，每次15 min；采用布氏漏斗过滤，得滤液。滤渣再用200 mL质量分数1%盐酸的乙醇溶液重复提取2次，将3次滤液合并，于40℃下真空浓缩去除乙醇，然后用质量分数1%盐酸的去离子水定容至10 mL备用。

将上述提取液经Sepabeads SP700型大孔树脂柱分离，去除提取物可能含有的脂溶性成分、非极性糖类成分、有机酸类。用水，体积分数为10%，30%，60%，90%的乙醇水溶液各200 mL分别洗脱粗提物，用5个锥形瓶分别接取洗脱液，分别经过旋蒸仪减压浓缩后，用色谱纯甲醇或去离子水溶解浓缩产物，用色谱甲醇定容至5 mL，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液I，II，III，IV，Ⅴ于冰箱中冷藏。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱，四元泵；流动相A为水（含2%冰醋酸水溶液），流动相B为甲醇；流速1 mL/min，进样量20 μL，柱温30℃，检测波长280 nm。梯度条件：0～25 min，10%～30%B；25～32 min， 30%-80%B； 32～50 min，80% ～100%B；50～60 min，100%B；60～61min，100%～10%B。

1.2.4 ABTS法

使用ABTS法测抗氧化性，在参考文献的基础上[12]稍加修饰。取10 μL的样品溶液加入2 mL ABTS+溶液避光反应2 min，空白试验加入2 mL水反应2 min。

ABTS+溶液的配置：用天平称取54.8 g ABTS+溶于20 mL磷酸盐缓冲液（pH值7.0），加入1 g的MnO2，活化20 min。取2 mL活化好的溶液离心，用磷酸缓冲溶液稀释上清液，使其A734（t0）=0.800±0.02 nm。然后于734 nm处测量吸光度。以维C作为对照，计算IC50值。

依据以下公式，可以计算出ABTS+的清除率：

式中：A0——空白溶液的吸光度值；

At——样品与ABTS+反应后的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 方法的专属性

对于样品I，II，III，IV，V和标准品待测液进行HPLC测定，发现IV和标准品待测液在47.3 min左右的时间内出峰，再在IV样品中加入了适量的标准品待测液，对其进行HPLC测定，发现峰面积明显变大，确定IV样品中含有原花青素，而其他样品中未检测出明显的目标峰。以30%乙醇水洗脱得到的组分色谱图为例，如图2所示。

30%乙醇水溶液洗脱得到的组分色谱图见图2。

图2 30%乙醇水溶液洗脱得到的组分色谱图

由图2可见，30%乙醇水溶液洗脱得到的组分色谱图中，在47.3 min附近无明显的色谱峰，因此不采用这一洗脱液的组分进行黑豆皮原花青素的含量分析，同理，在水、10%乙醇水、90%乙醇水中均未检测出明显的目标峰，因此都被排除，而采用60%乙醇水作为树脂柱洗脱液得到的组分来进行原花青素的含量分析，其他洗脱液的目的在于分离无关杂质，方便HPLC分析。

原花青素对照品、样品I、样品I+对照品色谱图见图3。

图3 原花青素对照品、样品I、样品I+对照品色谱图

2.2 检测波长的选择

取适量的原花青素标品，对其进行紫外扫描，从得到的图形中可以看出原花青素在280 nm左右的地方有最大吸收，280 nm处为其特征吸收，所以确定280 nm作为高效色谱的检测波长。

原花青素对照品的紫外图谱见图4。

2.3 线性关系与检测限

由1.2.1配置的标准系列溶液在1.2.3的色谱条件下，经高效液相色谱仪测得原花青素的标准系列溶液的色谱峰面积，结果表明PC在5～500 μg范围内线性关系良好，回归方程为Y=3.578 9X-41.036，R2=0.980 5，标准曲线如图5所示。经HPLC测定，当PC峰高为仪器响应噪声的3倍量时，检测限为1 000 ng （S/N=3）。

图4 原花青素对照品的紫外图谱

PC标准曲线见图5。

图5 PC标准曲线

2.4 精密度试验

取质量浓度为100 μg/mL标准品待测液，连续进样5次HPLC测定，计算其峰面积，RSD为3.72%，仪器具有良好的精密度。

2.5 稳定性试验

取I号样品分别于0，2，4，8，12 h各进样一次HPLC测定，计算其峰面积，RSD为3.70%，证明在12 h内样品的稳定性可以得到保证。

2.6 重复性试验

精密称取黑豆皮样品5份，每份都是20 g，重复进行样品的制备工作，对5次制备所得的I号样品各进行1次HPLC测定，计算其峰面积，RSD为2.26%，表明了该试验具良好的重现性。

2.7 加样回收试验

取上述已经测得原花青素含量的I号样品共1.5 mL，平均分配到1，2，3号小瓶中，再用质量浓度100 μg/mL的标准品待测液定容至1 mL，分别上样进行HPLC 测定，计算得到回收率分别为106.13%，95.85%，102.30%，平均回收率101.43%，RSD为1.46%，结果显示该试验回收率良好。

2.8 样品含量测定

精密称取黑豆皮样品5份，每份都是20 g，按1.2.2节样品处理方法制备，测定各供试品溶液的峰面积，计算原花青素的含量。

黑豆皮PC含量的测定见表1。

2.9 ABTS+的清除能力比较

黑豆皮原花青素的ABTS+清除能力见图6。

表1 黑豆皮PC含量的测定（n=5）

图6 黑豆皮原花青素的ABTS+清除能力

通过测定某物质清除自由基的能力，即可表征其抗氧化活性强弱[11]。图6显示了黑豆皮中原花青素提取物对于ABTS+的清除效果明显，随着质量浓度的增加，清除能力增强，即其抗氧化活性与质量浓度间存在量效关系。半抑制量（IC50）为13.62 μg/mL，远小于阳性对照维C 98.23 μg/mL。

3 结论

研究采用吸附树脂分离纯化原花青素，分别通过对HP20型大孔树脂、AB-8型树脂、D101型树脂、Sepabeads SP700型大孔树脂的纯化过程进行摸索，经HPLC法分析，结果在相同质量浓度的情况下，Sepabeads SP700型大孔树脂纯化的原花青素峰面积最大，因此Sepabeads SP700型吸附树脂可以很好地富集原花青素。

黑豆为山西地产特色农作物，在山西吕梁地区资源丰富，试验采用HPLC法测定山西产地黑豆皮中原花青素的含量，结果表明，该测定法准确、重复性好、稳定性高。近年来，黑豆皮药食性的研究应用越来越受到广泛关注，其应用潜力越来越大，试验为黑豆皮的原花青素品质综合评价及控制提供参考依据。黑豆皮中的不同官能团的原花青素及其对抗氧化活性的影响，还有待于进一步研究与开发。