自噬在乙二醇诱导的大鼠肾内晶体形成中的调控作用*

李德荣，刘云龙，王 翔，孙 焱，康珏宁，刘 权， 何子奇，陶芝伟，关晓峰，邓耀良, 2△

(广西医科大学 1第一附属医院泌尿外科, 2附属琅东医院泌尿外科， 广西 南宁 530021)

草酸钙肾结石以其高发病率和高复发率被研究者重视[1-2]，然而到目前为止，草酸钙肾结石形成的机制仍不明确。研究表明，自噬在肾脏疾病的发生发展过程中起到重要的作用[3-4]。自噬是一种在营养缺乏和氧化应激时，细胞利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，在维持细胞内环境的稳定方面发挥重大作用。自噬已广泛涉及肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病及衰老等多种病理生理过程[5-6]。自噬在疾病过程中的作用越来越引起人们的关注，然而，自噬在肾结石形成中的作用仍不明确。本研究拟通过乙二醇诱导建立大鼠草酸钙肾结石模型，首先检测大鼠肾脏内自噬水平的变化，然后通过应用自噬调节剂和抗氧化剂，探讨自噬在大鼠草酸钙肾结石形成中的作用及其机制，为草酸钙肾结石的防治提供新的策略。

材 料 和 方 法

1 动物

40只雄性SPF级SD大鼠，体质量180～220 g，由广西医科大学实验动物中心提供,许可证号SCXK(桂)2014-0002。

2 主要试剂

氯喹(chloroquine,Chlo)、雷帕霉素(rapamycin,Rapa)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)(Sigma)；兔抗LC3B多克隆抗体(Cell Signaling Technology)；BCA 蛋白浓度测定试剂盒和钙盐染色Von Kossa硝酸银法(北京索莱宝)；总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)试剂盒和谷胱甘肽过氧物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)试剂盒(南京建成)；大鼠肾损伤分子1 (kidney injury molecule 1，Kim-1)和大鼠中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL) ELISA试剂盒(武汉华美生物)。

3 方法

3.1动物分组 按完全随机法分5组，每组8只：正常对照(normal control, NC)组(正常饮食)；结石模型(model)组(自由饮用0.75%乙二醇溶液)；雷帕霉素处理(Rapa)组(自由饮用0.75%乙二醇溶液+腹腔注射雷帕霉素溶液 0.25 mg·kg-1·d-1)；氯喹处理(Chlo)组(自由饮用0.75%乙二醇溶液+腹腔注射氯喹溶液 60 mg·kg-1·d-1)；NAC处理(NAC)组(自由饮用0.75%乙二醇溶液+腹腔注射NAC溶液 150 mg·kg-1·d-1)，均连续喂养4周。

3.2标本的采集与处理 4周后使用代谢笼收集24 h尿液，检测尿液中肾损伤因子Kim-1及NGAL的水平。用4%水合氯醛麻醉小鼠，下腔静脉取血(不抗凝)，离心后取血清检测肌酐及尿素氮含量。其次，用生理盐水进行原位肾脏灌注冲洗，取右肾，纵行剖开，一半浸泡在4%的多聚甲醛液中用于石蜡切片做病理分析，将另一半肾组织用于电镜检测;左肾做标记后移入-80 ℃冰箱保存。

3.3Western blot检测各组肾脏自噬相关蛋白LC3-II的表达 从肾组织提取蛋白，BCA定量，等量蛋白样本上样，SDS-PAGE分离蛋白，以湿转法将蛋白电转移至PVDF膜上，转移后用脱脂奶粉溶液将PVDF膜封闭，加入 I 抗 (1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加人 II 抗(1∶2 000)室温反应1 h，TBST洗膜，曝光显影，用ImageJ分析LC3-II蛋白表达情况。

3.4免疫组织化学检测各组肾脏自噬相关蛋白LC3-II的表达 4 μm厚石蜡切片，60 ℃恒温烘烤，脱蜡和水化，枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0)高压热修复，3%过氧化氢消除内源性过氧化物，山羊血清封闭，加 I 抗4 ℃过夜，37 ℃复温， 加 II 抗37 ℃孵育1 h，DAB染色，避光，苏木精复染2 min，盐酸乙醇分化，PBS返蓝，封片。对染色结果用Image-Pro Plus 6.0进行分析，测定各组LC3-II阳性反应物平均吸光度。

3.5透射电镜观察各组肾脏超微结构的变化 取各组肾组织，切成1 mm×1 mm ×1 mm大小的组织块，置于2.5%的戊二醛溶液中，4 ℃ 避光固定2 h，后用PBS液冲洗3次，电镜室制片进行透射扫膜，观察各组肾组织内自噬泡的数量。

3.6钙盐染色法检测各组肾脏钙盐沉积水平 选厚度5 μm石蜡切片，操作过程严格按钙盐染色试剂盒(Von Kossa硝酸银法)说明书进行。结果观察钙盐呈黑褐色或深黑色，细胞核呈蓝色。对钙盐沉积进行半定量分析，分为6级评判：钙盐沉积<1个记为0分；1个≤钙盐沉积≤10个记为1分；10个<钙盐沉积≤30个记为2分；30个<钙盐沉积≤50个记为3分；50个<钙盐沉积≤75个记为4分；76个≤钙盐沉积记为5分。

3.7酶标法检测各组T-SOD和GSH-Px抗氧化酶活力 用酶标法检测尿液T-SOD和GSH-Px活力，操作过程严格按试剂盒说明书进行。

3.8肾损伤因子Kim-1和NGAL的检测 收集24 h尿液，用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测各组尿液中NGAL及Kim-1水平，具体步骤按照说明书进行。

3.9血清中尿素氮和肌酐的检测 全自动生化仪检测血清中尿素氮及肌酐值。

4 统计学处理

用SPSS 22.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较用SNK-q法检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠肾组织自噬相关蛋白LC3表达的变化

Western blot 实验结果显示，与正常组对比，结石模型组大鼠肾脏中自噬相关蛋白 LC3-II 表达显著增高(P<0.05)；与结石模型组对比，雷帕霉素处理组和氯喹处理组大鼠肾脏自噬相关蛋白 LC3-II 明显升高(P<0.05)，而 NAC 处理组大鼠肾脏中的 LC3-II 蛋白则降低(P<0.05),见图1。

Figure 1.Comparison of LC3-II/LC3-I in the rats with different treatments. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

图1Westernblot检测各组大鼠肾脏中LC3-II的表达水平

2 免疫组化检测各组大鼠肾脏LC3表达情况

免疫组化结果发现，与正常组对比，结石模型组大鼠肾脏中LC3-II表达较正常组明显增多(P<0.05)；与结石模型对比，雷帕霉素处理组及氯喹处理组LC3-II表达增多，而 NAC 处理组大鼠肾脏中 LC3-II表达减少(P<0.05),见图2。

Figure 2.The expression of LC3-Ⅱ in the renal tissues of rats with different treatments detected by immunohistochemical staining (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

图2免疫组化检测LC3-Ⅱ在各组大鼠肾组织中的表达情况

3 电镜观察各组肾脏内自噬泡的变化

与正常组相比，结石模型组大鼠肾脏可见线粒体肿胀及自噬泡；与结石组对比，雷帕霉素处理组和氯喹处理组大鼠肾脏内自噬泡数量显著增多(P<0.05),而NAC处理组大鼠肾脏内自噬泡数量明显减少(P<0.05)；与正常组和氯喹处理组对比，雷帕霉素处理组和结石模型组大鼠肾脏内的线粒体可见明显的肿胀,见图3。

Figure 3.Observation of autophagic vacuoles in renal tissue under transmission electron microscope. The scale bar=1 μm. Yellow and red arrows indicated autophagosomes and autolysosomes, respectively. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

图3电镜下观察各组大鼠肾组织中自噬泡的变化

4 抗氧化酶GSH-Px和T-SOD活性的变化

与正常组对比，结石模型组抗氧化酶GSH-Px和T-SOD活性均下降；与结石模型组对比，雷帕霉素处理组抗氧化酶GSH-Px和T-SOD活性均下降，而NAC处理组和氯喹处理组大鼠抗氧化酶GSH-Px和T-SOD活性增高(P<0.05),见图4。

Figure 4.The changes of total superoxide dismutase (T-SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in the urine of different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

图4各组尿液中T-SOD和GSH水平的变化

5 血清肌酐和尿素氮含量的变化

同正常组对比，结石模型组血清肌酐及尿素氮含量明显增高(P<0.05)；与结石模型组对比，雷帕霉素处理组血清肌酐和尿素氮含量更高(P<0.05)；而氯喹处理组和NAC处理组血清肌酐和尿素氮含量则比结石模型组低(P<0.05)。与NAC处理组对比，氯喹处理组血清肌酐和尿素氮含量均有所下降,见图5。

Figure 5.The changes of blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (SCr) in different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

图5各组血清中BUN和SCr水平的变化

6 肾损伤因子Kim-1和NGAL的变化

同正常组对比，结石模型组尿液中的肾损伤因子NGAL和Kim-1水平均明显增高(P<0.05)；与结石模型组对比，雷帕霉素处理组的NGAL和Kim-1水平均明显增高(P<0.05)，而氯喹处理组和NAC处理组则降低(P<0.05)，这与血清肌酐和尿素氮含量的变化趋势相似。与NAC处理组对比，氯喹处理组肾损伤因子Kim-1和NGAL水平均有所下降,见图6。

Figure 6.The changes of kidney injury molecule 1 (Kim-1) and neutrophil geitinase-associated lipocalin (NGAL) in the urine of different groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

图6各组尿液中Kim-1和NGAL水平的变化

7 肾脏晶体沉积的变化

通过钙盐染色我们得出，在正常大鼠肾脏内无晶体沉积；在结石模型组中，我们观察到肾小管扩张和晶体沉积; 与结石模型组对比，雷帕霉素处理组肾小管管腔内晶体沉积数量增多而且肾小管管腔扩张更明显，而氯喹处理组和NAC处理组晶体沉积和组织病理学变化有所改善；与NAC处理组对比，氯喹处理组晶体沉积数量更少，见图7。

讨 论

我们的前期研究表明，晶体-细胞反应在草酸钙肾结石的形成机理中起到了重要的作用[7-8],然而，其具体的作用机制仍不明确。新近的研究发现，自噬在许多肾脏疾病中扮演了重要角色[3-4]。自噬是真核细胞内一种依赖溶酶体来降解胞内损伤的细胞器和变质蛋白质，并使降解产物被重新利用的过程，它可对细胞生长，发育、成熟分化及死亡进行调控，适度自噬可对机体有利，过度自噬对机体则可引起机体损伤[9]。炎症、免疫疾病、缺氧及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS) 等多种因素均可诱导自噬[10-12],而炎症和 ROS 又在结石的形成过程中扮演着重要的作用[13-14]。此外，本课题组的前期研究发现，ROS介导的自噬可以加重CaOx晶体诱导的肾小管上皮细胞损伤[15]。因此，我们推测自噬在草酸钙肾结石的形成过程中发挥着重要的作用。

Figure 7.The results of Von Kossa staining (×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsmodel group.

图7钙盐染色结果的比较

为证实该假设，本研究拟通过乙二醇诱导建立大鼠草酸钙肾结石模型，并分别应用自噬调节剂雷帕霉素和氯喹及抗氧化剂NAC进行干预，通过Western blot、免疫组化及电镜观察检测各组肾脏中自噬关键蛋白LC3-II表达水平和自噬泡的数量，从而评价各组大鼠肾脏内自噬水平的变化。通过检测各组肾脏内T-SOD和GSH-Px 的水平，来探讨自噬的激活是否由ROS介导。钙盐染色评价肾脏内晶体的沉积情况，通过检测血清肌酐和尿素氮含量、尿液KIM-1和NAGL的水平来反映肾脏的损伤程度。

微管相关蛋白1 轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3， MAP1-LC3，LC3)定位于自噬泡膜表面并参与自噬泡构成，未发生自噬时以I型LC3存在，当发生自噬I型LC3发生改变，形成LC3 II，其数量与自噬泡数量呈正相关，LC3-II表达量可一定程度上反映自噬水平，因此Western blot及免疫组化检测肾脏自噬相关蛋白LC3是观察自噬现象较为可靠的生物学标志物[16]。透射电镜是检测自噬体和自噬溶酶体形成的金指标，在电镜下可见自噬体是300～500 nm大小月牙型或杯口型双层膜囊泡状结构，当其与溶酶体结合后变成单层膜的自噬溶酶体[17]。此外，SOD和GSH是ROS的清除剂，当ROS升高，SOD和GSH因消耗ROS而降低，可以间接定性反映体内ROS水平。抗氧化剂NAC是谷胱甘肽合成前体，NAC具有抗氧化能力，可干扰自由基的产生和清除已生成的自由基[18]。

本研究发现，与正常组相比，大鼠草酸钙结石模型组肾组织中自噬泡的数量增多、LC3-II表达增高、SOD和GSH活性下降、肾脏内晶体沉积增加，从而表明乙二醇不仅可以诱导大鼠草酸钙肾结石的形成，而且可以激活肾脏内自噬和ROS的产生。与结石模型组相比，雷帕霉素处理组和氯喹处理组中自噬水平均增加，其中，雷帕霉素处理组中ROS水平和晶体沉积进一步增加，而氯喹处理组则相反。在NAC处理组中自噬与ROS水平均下降，并且晶体沉积减少。因此，我们推断ROS介导的自噬促进了草酸钙肾结石的形成，而抑制自噬则能够有效地降低乙二醇诱导肾脏内晶体的沉积。

Kim-1 是一种敏感性和特异性都较高的早期诊断肾小管损伤的标志物，在评价急性肾损伤患者疾病严重程度和预后有重要作用[19]。NGAL 在正常肾脏微弱表达，肾损伤后，NGAL mRNA和蛋白表达均显著上升，而且NGAL较易从血液和尿液标本中被检测出来，因此常作为肾脏损伤的检测指标[20]。本研究发现，与草酸钙结石模型组对比，雷帕霉素处理组中Kim-1及NGAL的水平均明显上升，而氯喹处理组和NAC处理组均下降，表明在结石形成过程中自噬的激活进一步加重了肾脏的损伤。

本课题组及其它学者研究发现，抗氧化剂对预防肾结石的形成有显著意义，如牛磺酸和NAC，抗氧化剂可以通过减少ROS的形成，从而减少对肾脏损伤，降低结石形成[21-23]。而氯喹可通过抑制自噬体与溶酶体的结合，起到抑制自噬的作用[24]。本研究发现，与NAC处理组相比，氯喹处理组大鼠的血清肌酐、尿素氮、Kim-1及NGAL的表达水平均下降，并且肾脏晶体沉积减少，表明氯喹可能在防治肾结石的形成中有一定的疗效。

自噬是一把双刃剑，适度的自噬可以对机体起到保护作用，而过度自噬则进一步对机体造成损伤[9]。综上所述，我们推断在结石形成的过程中，高草酸尿和草酸钙晶体不断地刺激肾小管上皮细胞，引起细胞的损伤，产生氧化应激，释放出ROS，介导自噬过度的激活，从而促进炎症因子的释放，加重肾脏的损伤，最终诱导肾结石的形成。然而，其具体的调控机制仍需更深入研究。