黔产薏苡仁油成分分析及对破骨细胞活性的影响

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(1.贵州大学酿酒与食品工程学院,贵州贵阳 550025;2.贵州省药食同源植物资源开发工程技术研究中心,贵州贵阳 550025;3.贵州大学中药天然药研发中心,贵州贵阳 550025;4.西南药食两用资源开发利用技术国家地方联合工程研究中心,贵州贵阳 550025;5.贵阳中医学院药学院,贵州贵阳 550025)

薏苡仁(Coixlacryma-jobiL.var.mayuen(Roman.)Stapf)为一年或多年生禾本科植物薏苡的种仁,我国大部分地区都有生产,贵州兴仁为主产区之一,约占全国薏仁种植面积的80%。兴仁薏仁米产于贵州省黔西南州,是国家质检总局地理标志产品。薏苡仁除药用外,还常常作为副食品用,故被用作药食两用资源[1]。薏苡浑身是宝,已被国内外学者广泛研究,其主要化学成分为油酯类、糖类、蛋白质类、矿物质及其他[2]。其药理作用研究表明,薏苡仁具有抗肿瘤[3]、降血糖[4]、抗溃疡、止泻[5]、消炎镇痛[6]、降血脂[7]等功效。

已有研究报道,Yang R S等[8]利用去卵巢抗骨质疏松大鼠模型评估了薏苡仁水提物对骨质疏松症预防的影响,这一发现提示薏苡仁提取物有着能够逆转大鼠骨质疏松状态的功效,故而薏苡仁具有作为有效预防骨质疏松症的健康食品的潜力。有相关研究表明薏苡仁种子中含量最多的成分为薏苡仁油[9],故本实验将对黔产薏苡仁进行薏苡仁油脂的提取并对其进行脂肪酸的GC-MS分析,进一步将不同浓度的黔产薏苡仁油(0.98、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25 μg/mL)作用于1α,25-(OH)2VitD3诱导的原代分离的新西兰乳兔骨髓细胞[10],以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)+细胞数、TRAP酶活力及骨陷窝面积作为指标,来反映薏苡仁油对抑制破骨细胞分化及骨吸收活力的影响[11],为研究薏苡仁对骨质疏松症的预防作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黔产薏苡仁 来自中国薏仁米之乡——兴仁县原产地;新西兰乳兔(出生48 h以内) 贵阳经济技术开发区鹏程农业科技有限公司,合格证号:SCXK(黔)2012-001;骨磨片 兰州军区兰州总医院骨科研究所;α-MEM培养基 美国Gibco公司;胎牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)测试盒 南京建成生物工程研究所;MTT(噻唑蓝)、DMSO(二甲基亚砜) 北京索莱宝生物科技有限公司;甲苯胺蓝、1α,25-(OH)2VitD3、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒 日本Sigma公司。

HP6890/5975C气相-质谱联用仪 美国安捷伦公司;手动固相微萃取装置、萃取纤维(2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableF-lex) 美国Supelco公司;3110 水套系列CO2恒温恒湿培养箱、Multiskan FC多功能酶标仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;SJ-CJ-2FD超净工作台 苏州净化设备有限公司;DMi8-M倒置荧光显微镜 Leica Microsystemes CMS GmbH Ernst-Leitz-Str公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黔产薏苡仁油的提取与制备 本研究采用的是无水乙醇超声辅助法提取黔产薏苡仁油[12]:将成熟自然风干的黔产薏苡仁种子粉碎至物料粒径为60～80目后,称取50 g黔产薏苡仁粉末,料液比为(薏苡仁粉末∶无水乙醇)1∶3.5 g/mL,温度为50 ℃,超声功率350 W,超声频率30 kHz,提取时间40 min,最后得到2.2 g的黔产薏苡仁油。称取100 mg黔产薏苡仁油,用1 mL DMSO溶解,得浓度为1.0×105μg/mL母液,储存于4 ℃冰箱中备用。

1.2.2 黔产薏苡仁油的脂肪酸残基GC-MS分析 首先将黔产薏苡仁油甲脂化后,采用微量注射器注入样品溶液进行GC-MS分析,用标准脂肪酸甲脂作为参照来确定样品中的脂肪酸成分。GC-MS分析条件:采用FB-5MSI(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱,柱温为50～309 ℃(每分钟升温8 ℃);离子源温度230 ℃;离子源为EI源;电子能量70 eV。对总离子流图中的各峰均用质谱计算机数据系统进行分析和处理,同时通过核对Nist2005和Wiley275标准质谱图,确定了黔产薏苡仁油脂肪酸残基中的14种挥发性化学成分,各化学成分均使用峰面积归一化法测定其相对质量分数。

1.2.3 骨髓细胞的分离与培养 将购买来的出生48 h以内的新西兰乳兔,断颈处死,用75%乙醇浸泡15 min以上,在超净工作台中取出乳兔后肢,浸泡于PBS中,用医用纱布剥离出股骨,浸泡于含10%血清的α-MEM完全培养基中,用手术剪纵向剪开乳兔股骨,用手术刀轻轻刮下骨髓内细胞,吹打混匀后涡旋30 s,用200目细胞筛过筛,获得乳兔原代骨髓细胞。根据实验需求,96孔培养板:将原代骨髓细胞调整细胞浓度至5×105个/mL后接种,48孔培养板:将原代骨髓细胞调整细胞浓度至2×106个/mL后接种。于5% CO2、37 ℃、饱和湿度条件下培养稳定24 h后,用适量PBS轻轻洗一遍。

1.2.4 对骨髓细胞存活率的影响 用含10%血清的α-MEM完全培养基,采用倍半稀释法,将黔产薏苡仁油调整为不同浓度(0.06～1000 μg/mL)培养液后加入到接有原代骨髓细胞的96孔培养板中,实验设置空白组(空白培养液为不含薏苡仁油,含10%血清的α-MEM完全培养基)。之后每2 d更换一次培养液,药物作用6 d后,换入含10%的5 mg/mL MTT的α-MEM完全培养基,置于37 ℃恒温培养箱中孵育4 h,用注射器小心吸弃上清液,每孔加入适量DMSO,振荡10 min,使用多功能酶标仪在波长490 nm处检测OD值。

1.2.5 实验分组 分别设置实验组:含不同浓度黔产薏苡仁油(A:31.25 μg/mL,B:15.63 μg/mL,C:7.81 μg/mL,D:3.91 μg/mL,E:1.95 μg/mL,F:0.98 μg/mL)的10%血清及10-8mol/L 1α,25-(OH)2VitD3的α-MEM完全培养基;阳性对照组G:含10-8mol/L雌二醇的10%血清及10-8mol/L 1α,25-(OH)2VitD3的α-MEM完全培养基;阴性对照组H:含10%血清及10-8mol/L 1α,25-(OH)2VitD3的α-MEM完全培养基。

1.2.6 TRAP染色 将不同的实验分组加入到接有原代骨髓细胞的48孔培养板中,每隔2 d换一次培养液,药物连续作用8 d后,吸去上清液,用PBS轻轻洗一遍,用固定液(25%柠檬酸缓冲盐,10%甲醛,65%丙酮)固定5 min,双蒸水轻轻洗一遍,将水吸干,加入染液,37 ℃避光孵育1 h,显微镜下观察,拍照,用双蒸水轻轻洗一遍,用苏木素复染5 min,流式冲洗返蓝,显微镜下对TRAP阳性细胞(细胞胞浆内形成紫红色沉淀、多核)计数、拍照。

1.2.7 TRAP酶活力测定 按照实验分组将不同浓度药物加入到接有原代骨髓细胞的48孔培养板中,每隔2 d换一次培养液,药物作用8 d后,吸去上清液,用PBS轻轻洗一遍,每孔加入适量裂解液(0.2% Tritanx-100),置于37 ℃恒温培养箱裂解5～10 min,取细胞裂解液按抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒说明书操作。

1.2.8 骨吸收陷窝面积测定 按照实验分组将不同浓度药物加入到接有原代骨髓细胞(提前放有6 mm×6 mm大小骨磨片)的48孔培养板中,每隔2 d换一次培养液,药物作用8 d后,吸去上清液,用PBS轻轻洗一遍,用10%甲醛溶液固定5 min,用双蒸水轻轻洗一遍,加入0.25 mol/L的氨水超声5 min,依次采用适量80%、85%、95%无水乙醇梯度洗脱,每次2 min,用0.1%甲苯胺蓝溶液染色5 min,最后使用荧光倒置显微镜拍照并计算面积。

1.3 统计学分析

所有数据均使用SPSS 21.0软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 黔产薏苡仁油的脂肪酸残基GC-MS分析

结合GC及GC-MS技术(图1)确定薏苡仁油的脂肪酸残基分别为十四烷酸(肉豆蔻酸)、十六烷酸(棕榈酸)、十八烷酸(硬脂酸)、十八碳一烯酸(油酸)、十八碳二烯酸(亚油酸)、二十二烷酸(山嵛酸)、角鲨烯和γ-谷甾醇(见表1、表2),都为碳数12以上的脂肪酸。

图1 黔产薏苡仁油的总离子流图Fig.1 Total ion current diagram of Coix seed oil in Guizhou

表1 黔产薏苡仁油的脂肪酸残基特征碎片离子解析表Table 1 Fatty acid residue characteristic fragment ion analysis table of coix seed oil in Guizhou

表2 黔产薏苡仁油中的脂肪酸残基有效成分定性分析Table 2 Qualitative analysis of effective components of fatty acid residues in coix seed oil in Guizhou

2.2 对骨髓细胞存活率的影响

原代骨髓细胞培养7 d后,显微镜观察发现,细胞能均匀铺满96孔培养板底部,将不同浓度黔产薏苡仁油(0.06～1000 μg/mL)培养液作用于兔原代骨髓细胞6 d后,与空白组相比,细胞存活率随浓度的升高而不断降低,当浓度高于31.25 μg/mL时,细胞存活率低于100%(见图2)。当细胞存活率趋于稳定时(在100%附近)可认为该药物浓度对该细胞毒性较小,从而排除药物毒性对实验的干扰,故选择0.98、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25 μg/mL作为实验浓度最为适宜。

图2 黔产薏苡仁油对骨髓细胞存活率的影响Fig.2 Effect of coix seed oil in Guizhou on survival rate of bone marrow cells

2.3 TRAP染色

通过比较TRAP阳性细胞数目及大小,可以衡量破骨细胞活性大小(表3，图3)。各浓度组与阴性对照组TRAP阳性细胞计数相比,均具有显著性(p<0.05),阴性对照组TRAP阳性细胞数目较多,且体积大、核较多,阳性对照组和黔产薏苡仁组TRAP阳性细胞数目均相对较少,且体积小、核少;黔产薏苡仁油不同浓度组的TRAP阳性细胞数随样品作用浓度升高而逐渐减少,其中高浓度A组31.25 μg/mL的TRAP阳性细胞数最少,且细胞较小,存在明显的浓度依赖性。

图3 TRAP阳性细胞染色Fig.3 TRAP positive cells staining注:A:黔产薏苡仁油31.25 μg/mL组;B:黔产薏苡仁油15.63 μg/mL组;C:黔产薏苡仁油7.81 μg/mL组;D:黔产薏苡仁油3.91 μg/mL组;E:黔产薏苡仁油1.95 μg/mL组;F:黔产薏苡仁油0.98 μg/mL组;G阴性组;H阳性组。表3、图4、图5同。

表3 TRAP阳性细胞数及TRAP酶活力的影响Table 3 Effects of TRAP positive cell number

2.4 TRAP酶活力测定

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)在破骨细胞里面是一种特殊的标志性磷酸酶,所以可以用TRAP酶活来衡量破骨细胞活性。由表3可知,与阴性对照组相比,各浓度组均具有显著性差异(p<0.05),阴性组TRAP酶活力较大,各不同浓度给药组的TRAP酶活力随作用浓度的升高而逐渐下降,其中高浓度A组31.25 μg/mL的酶活力明显较低,且存在明显的浓度依赖性,与TRAP阳性细胞数结果相一致。

2.5 骨陷窝面积

骨吸收陷窝则是破骨细胞在机体内部进行骨吸收过程的直接结果,因此可以用这一指标来反映破骨细胞的活性。由图4、图5可知,与阴性对照组相比,各浓度组均具有显著性差异(p<0.05),阴性组骨陷窝面积较大,各不同浓度给药组骨陷窝面积随作用浓度的升高而逐渐减少,其中高浓度A组31.25 μg/mL的骨陷窝面积明显较低,且存在明显的浓度依赖性,与TRAP阳性细胞数及TRAP酶活结果相一致。

图5 骨膜片染色Fig.5 Periosteum staining

图4 骨陷窝面积结果Fig.4 Results of bone lacunae

3 讨论与结论

在骨吸收、代谢的过程中,主要由成骨细胞负责骨形成,破骨细胞负责骨吸收,而在机体里面为了维持正常的骨量,骨吸收和骨形成一直处于一个动态平衡过程,如果这一平衡被打破将会产生诸多骨病,如骨质疏松、骨硬化等,因此研究药物对破骨细胞的活性影响可以推测出该药物是否对骨质疏松症具有一定的预防和治疗作用[13]。而抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)在破骨细胞里面是一种特殊的标志性磷酸酶,所以通常把TRAP酶活作为衡量破骨细胞活性的一个重要标志[14];骨吸收陷窝则是破骨细胞在机体内部进行骨吸收过程的直接结果,因此也可以用这一指标来反映破骨细胞的活性。

本实验首先通过无水乙醇超声辅助法对黔产薏苡仁油进行提取,并对其成分进行GC-MS分析,脂肪酸残基GC-MS分析得出黔产薏苡仁油的脂肪酸残基主要为十四烷酸(肉豆蔻酸)、十六烷酸(棕榈酸)、十八烷酸(硬脂酸)、十八碳一烯酸(油酸)、十八碳二烯酸(亚油酸)、二十二烷酸(山嵛酸)、角鲨烯和γ-谷甾醇;亚油酸是一种必需脂肪酸,在黔产薏苡仁油中的含量超过31.793%,具有增强机体免疫力、促进骨组织代谢和抗肿瘤等作用[15];油酸则是黔产薏苡仁油中最主要的不饱和脂肪酸,具有良好的抗炎、抗氧化性[16];角鲨烯具有增强机体免疫能力、抗炎、抗氧化及抗肿瘤等生理活性[17];相关研究表明,破骨细胞的活化有两条通路:主要通路是RANKL/RANK/NF-κB或JNK通路;次要通路是IL-1、TNF-α等炎症因子激活的非RANKL/RANK依赖通路,两者是相互联系的,炎症都参与激活破骨细胞分化的两条通路,而破骨细胞又是骨吸收过程中的最终作用细胞,因此炎症的产生可以通过增加破骨细胞的活性,来使其在骨吸收中发挥重要作用[18]。在进一步的黔产薏苡仁油对破骨细胞活性影响实验中,TRAP染色、TRAP 酶活力分析和骨吸收陷窝面积的结果均表明,黔产薏苡仁油能显著抑制破骨细胞的活性。在本实验的研究中,黔产薏苡仁油抑制破骨细胞活性的影响均呈现良好剂量依赖性,高浓度组对破骨细胞活性的抑制作用较强,该抑制作用随着药物浓度的降低而不断减弱,其中高浓度剂量A组31.25 μg/mL的抑制作用最为显著(p<0.05)。

由实验结果可以推测,黔产薏苡仁油对骨质疏松具有一定的预防和治疗作用,这种作用可能是通过抑制破骨细胞活性来实现的。本实验为进一步研究薏苡仁对骨质疏松症的预防作用奠定了基础,而薏苡仁油在调节骨吸收和代谢平衡中的作用及其机制,还有待于更进一步的研究。