微藻油的提取与功能研究进展

2019-04-01 06:40,,,,,*,,,*
食品工业科技 2019年5期
关键词:鲨烯酶法微藻

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(1.福建农林大学食品科学学院,福建福州 350002;2.福建农林大学海洋研究院,福建福州 350002;3.福建农林大学国家菌草工程技术研究中心,福建福州 350002)

海洋单细胞藻类即微藻,是地球上出现最早的生物物种,由于种类不同,它们的尺寸从几微米到几百微米不等[1]。微藻的种类繁多,已知的海洋微藻种属被分为绿藻门、金藻门、甲藻门、红藻门和蓝藻门5个主门,门下设纲,主要分为绿藻纲(Chlorophycreae)、金藻纲(Chrysophyceae)、硅藻纲(Bacillariophyceae)、定鞭金藻纲(Prymnesiphyceae)、甲藻纲(Pyrrophyceae)、红藻纲(Rhodophyceae)、蓝藻纲(Cyanophyceae)等[2]。根据微藻的生活方式,可分为浮游微藻和底栖微藻两大生态类群;根据微藻生长环境的不同,又可分为水生微藻、陆生微藻与气生微藻三种生态类群[3]。微藻作为低等植物可以生长在海洋、河流以及湖泊里,适应环境能力强、生长周期短、产量高。它能有效地利用太阳能将H2O、CO2和无机盐类转化为有机物,是地球有机资源的初级生产者[1]。微藻的生长不会与其他油料作物争夺土地,节省土地资源。可以利用边际陆地、废弃湖泊、废水和CO2,有利于环境治理。

微藻中含有蛋白质、脂肪、碳水化合物和维生素等人类所必需的营养素,油脂含量较高,中性脂的含量约占细胞干重的20%~50%,少数微藻可达75%,单位产油量显著高于农业油料作物。因此微藻油被认为是最具发展潜力的油脂资源,在国际上受到极大关注[4]。但是大部分微藻细胞壁由纤维素和果胶组成,比较坚韧,阻碍细胞内油脂的萃取,因而在微藻油萃取前需对微藻进行破壁处理以提高微藻油提取率。另外,油脂在微藻细胞中的分布和组成受微藻种类及生长环境的影响,很难采用统一的方法高效萃取微藻油[5]。在微藻常见的门类中,硅藻门、绿藻门、金藻门等门类中油脂含量较高。在绿藻门中培养较多的有小球藻、拟微球藻、莱茵衣藻、雨生红球藻等,其中拟微球藻油脂含量最高;常见的硅藻种类有三角褐指藻、角毛藻、小新月菱形藻、小环藻等,其中三角褐指藻油脂含量最高;培养较多的金藻有盐生巴夫藻、路氏巴夫藻等,其中路氏巴夫藻含油量更高一些[6]。绿藻门微藻和硅藻门微藻的平均总脂含量大概为干重的26%,金藻门微藻主要分布在淡水中,其平均总脂含量高于绿藻门和硅藻门的[7]。

目前常用的藻油萃取技术有水酶法[8]、反复冻融法[9]、超声、微波法[10]、超临界流体萃取法、亚临界萃取法、微负压法等[11]。随着微藻油提取和检测技术的深入研究,人们也越来越重视其功能特性的研究。微藻油中含有丰富的多不饱和脂肪酸,其含量远高于鱼类,且具有抗炎症、抗肿瘤、调节血脂和血糖、提高免疫力、预防心血管疾病等功能[12]。目前,微藻油主要应用于饲料业、食品、营养保健品、生物柴油等领域。本文主要综述了近年来微藻油提取方法及其功能的研究进展,通过介绍各种微藻油提取方法的优缺点及其多不饱和脂肪酸的功能特性,进而为微藻油研究工作提供一定的参考。

1 微藻油的提取方法

海藻油是海藻中全部油类物质的总称,常温下多为略带腥味的淡黄色液体。海藻按其大小可分为大型藻类和微藻类,微藻油含量较高,而以大型海藻为原料提取油脂的报道较少[13]。微藻是真核生物,细胞壁结构具有多样性,细胞壁的存在阻碍了提取溶剂进入细胞,从而降低微藻油的提取效率,因此微藻难以破壁是微藻油提取的关键技术瓶颈。破壁方法分为机械方法和非机械方法;机械方法主要包括超声波法、珠磨法、反复冻融法、高压匀浆法、微波法、脉冲电场法、蒸汽喷发法、水热汽化等;非机械方法主要包括酸法、酶法、离子液法、纳米粒法、渗透冲击法和表面活性剂等方法;将机械方法和非机械方法简单的划分又可分为化学法、物理法、物理化学法和生物法四种方法[14]。

1.1 化学法

化学法提取微藻油是指通过使用化学试剂来破坏细胞壁,从而提取出细胞内脂质,通常被认为是一种低能耗、低投资、易于扩大规模的方法;但是在实际操作中仍有许多问题待解决,例如化学试剂的生物毒性,脂质降解等方面的问题;由于不同种类的海藻细胞壁的结构组成和强度不同,因此要根据海藻类别选择合适的化学试剂,否则会对海藻油的提取效率产生影响[15]。

1.1.1 有机溶剂法 Choi等[16]用三种有机溶剂系统:己烷、己烷/甲醇(7∶3,v/v)、氯仿/甲醇(1∶1,v/v)混合后提取脂质,混合有机溶剂与小球藻以19∶1的质量比混合后,经过搅拌、离心后,脂质的提取率达到378 mg/g。Lee等[17]开发了一种利用二甲基碳酸二甲酯(DMC)提取脂质的高效方法,DMC和甲醇混合物(7∶3,v/v)从干的微藻中脂质提取率可达到38.9%。

微藻油的提取是在有机溶剂提取为基础的酯交换过程,但是在酯交换之前要除去有机溶剂,进行溶剂回收,因此可以通过溶剂回收的工艺来降低总成本并避免有机溶剂对藻油的安全性产生影响。Dos Santos等[18]比较了四种不同的溶剂体系(乙醇,己烷和两种氯仿/甲醇比例不同的混合物),脂质产量达到190 mg/g。利用化学溶剂萃取产油微藻中的油脂,具有操作简单便捷,易于油脂分离的优点。虽然化学试剂具有高度选择性和对油脂较好的溶解性,但是耗时长,易受有机溶剂在微藻粉中的分散性及两者接触面的影响。

1.1.2 酸法 微藻细胞的细胞壁中的糖聚合物可被适当浓度的酸分解,特别是硫酸,由于其高效和低成本的优点,常用于化工业[19]。2014年,Park等[20]研究了硫酸作为催化剂从小球藻中提取脂质的方法,在120 ℃热处理60 min的条件下,脂质提取产率高达337 mg/g。刘颖[21]利用2 mol/L的盐酸破坏微藻细胞,其破碎效果明显,油脂提取率可达到65%,且酸浓度越高破碎效果越明显。由于酸易破坏细胞内的有效成分,所以一般不选择高浓度的强酸用于微藻的生物炼制,因此在酸法提取的过程中首先要选择适合相应微藻的试剂,同时要选择适宜的配比和适宜的浓度。

1.2 物理法

物理法提取海藻油主要是指利用物理或机械的方法破坏海藻的细胞壁,如能量转移(超声波和微波)、固体剪切(珠磨法)、液切变(高压匀浆法)和热压法(蒸汽喷发、水热汽化)等方法[14]。物理法需要以剪切力、电脉冲或热量等形式进行能量输入,具有高产品回收率、良好的可控性和可扩展性的优点。由于高压或剪切应力或温度会损坏挥发性细胞内化合物,因此一些物理方法不适合于这些化合物,但适用于脂质。可采用物理方法与化学方法相结合,以减少能源消耗,提高破碎微藻细胞壁的效率[14]。

1.2.1 超声波和微波法 超声波法是将超声波传递至细胞内,利用声波传递的作用在细胞表面产生较大的动能,从而达到破碎细胞的效果,以2×104~2×109Hz的声波进行工作,具有热效应、机械效应和空化效应,而超声波对萃取分离的强化作用主要来源于超声空化。利用超声波和有机萃取的方法提取海藻油是现在比较常用也是提取效率较高的一种方法,Piasecka等[22]利用了超声波破坏细胞,随后利用氯仿/甲醇提取小球藻油,脂质提取率高达422 mg/g。除了利用超声波提取海藻油,微波也是现在常用的方法。

微波是一种频率为300 M~300 GHz的电磁波通过样品发生激活作用而使其与机体分离。Cheng等[23]利用微波法破坏细胞壁,从小球藻中提取藻油的提取率为5%~18.7%,而常规使用氯/甲醇的方法脂质提取率为20.4%,相比较而言,微波法的提取效果较差。这可能是由于微波提取使用的是湿细胞,而传统方法使用的是干细胞。

徐椿慧等[24]利用超声波-微波协同萃取法提取混合海藻粉(浒苔、海带、小球藻)中海藻油,根据不同因素进行单因素实验,确定了超声功率100 W、提取时间40 min、提取温度45 ℃、料液比1∶3 g/mL、微波功率250~400 W为最佳提取工艺条件,同时也发现单独使用超声波或微波不如超声波-微波联合使用的效果好。超声波法和微波法是用于破碎微藻细胞壁的有效方法,但是由于耗能较高,在今后的放大生产中还有很大的阻力。

1.2.2 珠磨法 珠磨法是将细胞悬浮液与玻璃珠进行混合,通过物理摩擦达到破碎细胞的效果。珠磨破坏微藻细胞壁是一种在液态环境中提取微藻细胞内脂质的有效手段。鉴于其在单程操作中的高中断效率,易于放大程序和低劳动强度,珠磨具有很高的工业实施潜力[25]。孙珊[26]比较了研磨法、冻融法、乙醚石油醚法、氯仿甲醇法和酸热法5种方法与有机溶剂组合对4种微藻(金藻、前沟藻、异湾藻、原甲藻)油脂提取率的影响,结果发现四种微藻使用冻融法破壁效果最好。2016年,Taleb等[27]通过观察高压珠磨破碎器破碎1 L培养液中微拟球藻细胞的破壁程度,发现细胞壁破碎率达到98%,因此,珠磨法更适用于提取液态环境中的微藻脂质。

1.3 物理化学法

物理化学方法提取海藻油是指在有机溶剂的存在下,利用超声波、微波、均质等物理方法破坏海藻细胞。Santos等[28]利用超声波辅助氯仿-甲醇提取小球藻油,微藻油的提取率达到19%,在这些脂类中甘油三酯的占比达到55%。Neto等[29]使用超声辅助己烷从干燥的小球藻中进行脂质提取,得到155 mg/g的脂质产率。Piasecka等[21]报道,在己烷/甲醇和氯仿/甲醇混合物条件下,超声辅助处理小球藻,其油脂提取率达到42%。

将物理和化学两种萃取技术联合使用可以强化溶剂萃取微藻油的效率,如超声强化超临界法、超声辅助有机溶剂法等。多种技术的联用可以显著地提高海藻油的萃取效率,但也会使海藻油的生产工艺更加复杂,能耗和成本增大。

1.4 生物法

生物法是指利用生物预处理的方法将海藻的细胞壁进行酶解破坏,释放出油脂,同时有效回收功能成分的一种方法。微藻细胞壁的破坏可以通过裂解酶或溶藻酶处理的生物学方法来实现。生物法主要优点是生物学特异性、操作条件温和及能量消耗低等。

1.4.1 酶法和水酶法 酶法是生物法中最具有代表性的一种方法,且酶法破碎细胞的研究技术也已相当成熟。酶法破碎细胞主要是自溶或体外酶进行酶解。自溶法是通过破坏肽聚糖结构,使细胞壁孔隙增加,从而造成细胞的裂解。体外酶法主要是指一些体外的生物酶,包括纤维素蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶等。Wang等[30]发现在超声辅助下酶解法提取微拟球藻(Nannochloropsis)的油脂,其提取率达到38%。

水酶法是在酶法的基础上新兴的一种油脂提取方法,主要利用机械破碎油料,以水为分解相,采用相关的酶(如蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、维生素酶等)在水相中水解油料细胞壁从而使油脂从油料中释放出来[8]。刘颖[20]发现在一定条件下使用4 g/L的中性蛋白酶水解小球藻,其油脂提取率可达80%以上。吴兵兵等[31]在一定条件下采用两步酶法提取裂壶藻油,清油得率达到90.22%。张雨倩等[32]在酶添加量2%、料液比1∶25、酶解时间2 h、提取温度为45 ℃的条件下进行实验,藻油提取率达17.1%。荣辉等[33]采用水酶法从裂壶藻粉提取裂壶藻油,在料液比1∶7,中性蛋白酶添加量7%,碱性蛋白酶添加量10%的条件下清油得率为91.37%±0.14%。生物法与物理、化学方法相比,提取率高,油脂品质较好,同时能有效回收蛋白质等功能成分,但是酶的使用使得油脂的提取成本大大增加,同时藻种的不同和酶的选择都会对油脂的提取率产生很大的影响。

1.4.2 微生物法 微生物法是一种高效、低成本的藻细胞破碎预处理方法,其中具有代表意义的是能够对某些微藻起到特定破坏作用的细菌法,即溶藻菌法。溶藻菌是指能够抑制藻类生长或杀死藻类、溶解藻细胞细菌的统称。溶藻菌法是一种新兴的提取微藻油的方法,但我国目前对此的研究较少,大部分研究集中在溶藻菌株的分离鉴定、溶藻方式的探讨以及溶藻活性物质的分离纯化等方面[34]。Chen等[35]在利用小球藻与细菌(Flammeovirga yaeyamensis)共培养所获得的上清液对小球藻进行细胞破壁处理,由于共培养液中含有一些水解酶(即淀粉酶,纤维素酶和木聚糖酶),因此小球藻油提取率达到100%,章莹颖等[36]通过比较不同破壁方法对微藻细胞破碎和油脂提取效果的影响,发现溶藻菌有较好的细胞破壁效果,能提高油脂提取率。酶法和微生物法是生物法中较常见的两种方法,前者较后者研究更深入一些,溶藻菌的使用机制还需要进一步的研究探讨,从而为其进一步的应用提供理论基础。

2 微藻油的营养功能

脂类不仅是构成细胞膜的重要结构成分,也是所有生物生长不可或缺的营养成分,在能量储存中起着重要作用[37]。近年来,海洋生物脂类被发现具有特有的功能特性,因为海洋环境的特殊性,导致海洋生物脂类的化学结构、作用机理、功能特性等方面与陆地生物脂类具有显著的差异,具有自身特有的生理功能,如抗肿瘤、降血脂、增强智力、预防代谢综合征等。因此从海洋生物中获得天然脂类,是未来的重点研究方向[38]。微藻油是一种从海洋微藻中提取得到的天然保健食品,富含ω-3系多不饱和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid,ω-3 PUFA),主要包括二十二碳六烯酸(Decosahexaenoic acid,DHA)和二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA),相对含量如表1所示[39]。海藻油相比鱼油腥味较淡、污染物残留少、DHA含量更高,因而备受消费者喜爱,市场竞争力优势明显。研究发现[40],微藻油中不仅含有DHA、EPA等不饱和脂肪酸,而且还含有对人体健康有益的烃类和微量的醇类成分,其中角鲨烯和亚麻醇在微藻油中均有被检测出。

表1 四种微藻油中DHA、EPA的相对百分含量Table 1 Relative percentage contents of DHA and EPA from four kinds of microalage oil

2.1 微藻油中DHA、EPA的功能

DHA和EPA,同属于ω-3多不饱和脂肪酸,是大脑、神经和视觉细胞中重要的脂肪酸成分。这两种不饱和脂肪酸不仅是构成高等动物细胞的重要成分[41],而且对人体健康有着不可忽视的作用。DHA和EPA主要来源于DHA、EPA藻油。DHA、EPA藻油作为一种新型的脂质食品原料,在调制乳、食用油、保健食品、蛋糕、饮料等诸多食品领域均有应用。2010年3月,中华人民共和国卫生部第3号文件批准裂壶藻生产的DHA藻油作为一种新资源食品,推荐纯DHA食用量300 mg/d[42]。司华静等[43]发现DHA藻油与花生油混合后,不会影响花生油的口感和性质,还会降低花生油加工过程中DHA的损失率。黄巍峰等[44]研究DHA藻油对酸奶品质的影响,在30 d的储存保质期内藻油添加量为0.25 mg/g时,产品的感官品质比较稳定,不会出现藻腥味。DHA能增强记忆力,因而能提高学习效果,被称作“脑黄金”。Stordy等[45]研究表明DHA对成年人的大脑功能和行为反应也有重要的影响。藻油中的DHA还能降血脂,降低胆固醇,预防心血管疾病,在国际上高纯度DHA作为降血脂的药物,已经被《美国医师用药手册PDR》列为防治高血脂的第四类参考用药。Nelson等[46]研究表明,给高血脂的人每天食用1.5 g DHA,2~15周之后,甘三酯含量降低了14%~26%,高密度脂蛋白含量有明显的上升趋势。代荣阳等[47]研究发现藻油中的EPA具有抗炎的作用,经常食用含有EPA食物的人,患风湿性关节炎、牛皮癣等慢性炎症性疾病的机率较低。刘敬华等[48]研究发现,DHA可以通过p53依赖Fas介导途径诱导HepG2细胞凋亡。

2.2 微藻油中角鲨烯的功能

角鲨烯(Squalene)又称鲨烯、三十碳六烯、鱼肝油萜、Spinacene,是一种高度不饱和烃类化合物,也是一种脂质不皂化物。其化学名称为2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯,分子式为C30H50,相对分子量为410.7,属开链三萜。角鲨烯因其特殊的生物功能和药理作用而在药物和功能食品等相关领域中发挥着重要作用[49]。角鲨烯主要来源于深海鲨鱼油和橄榄油中,石金娥等[50]的研究发现,非复合型藻油中角鲨烯的含量达到4.13 g/kg,相比于角鲨烯含量之最的橄榄油中平均含量(3.83 g/kg),其角鲨烯的含量相当可观。鲨烯作为一种无毒性的且具有防病治病作用的海洋生物活性物质,在体内具有抗炎症、抗肿瘤、调节血脂和血糖等多种功能[51]。Liu等[52]发现角鲨烯通过调节糖脂代谢对心血管等代谢性疾病进程具一定调节作用。邱春媚等[53]发现角鲨烯具有耐缺氧的功能,同时并未发现角鲨烯的任何毒副作用。但是目前对于角鲨烯功能的研究主要集中在植物油脂和鲨鱼肝油来源的角鲨烯,对于藻油来源角鲨烯的功能鲜有涉及。

2.3 微藻油的其它功能

食品方面,微藻油可以作为功能性营养强化剂或直接做成保健产品。医药方面,微藻油中的功能性多不饱和脂肪酸可以作为药物使用。在养殖业中,微藻油可以加入饲料中,从而得到我们想要的功能性农副产品。一些含有功能性多不饱和脂肪酸的微藻油还具有改善精神分裂症状、治疗皮肤病等多种生理功能[54]。目前微藻油中的亚油酸和花生四烯酸在医学领域运用相当广泛,对治疗高血压、缓解支气管哮喘、鼻充血以及消化系统溃疡等疾病疗效十分显著[55]。同时微藻油中的多不饱和脂肪酸可以用于藻脂代谢的研究,目前研究较好的是单细胞绿藻莱茵衣藻(Chlamydo-monasreinhardtii)[56]。

3 结语与展望

本文主要概述了近几年微藻油的四种提取方法,分别是化学法、物理法、生物法和物理-化学法。化学法、物理法与生物法虽各有各自的优点,但是也存在各自的弊端。因此,将两种或多种萃取技术联合使用,如超声-微波协同萃取技术、超声强化超临界萃取法、超声辅助酶解法等,是提高海藻油萃取效率的有效途径。多种技术的联用能够将其优点结合起来,但是操作较为复杂,能耗较高。生物法因具有能耗低、操作简单和安全性较高的特点,在未来微藻油的产业化生产具有较大的优势,但是生物法的溶藻机制研究还不够深入,因此生物法的溶藻机制成为了现在待攻克的难题。随着人们对微藻油中功能性物质认识的不断加深,ω-3多不饱和脂肪酸和ω-6多不饱和脂肪酸功能的研究越来越深入,但是微藻来源的角鲨烯功能研究较少。研究发现不同藻油中活性物质甘油三酯与降血脂、抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力、健脑益智等功能有密切关系,且其结构类型存在差异功能也有很大不同,因此藻油中不同结构的甘油三酯活性有待进一步探究。

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