XAD-7型大孔树脂纯化黑果腺肋花楸多酚条件优化

张卉，王亚茹，刘洋峰

（沈阳化工大学制药与生物工程学院，辽宁沈阳110142）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa），又名野樱莓、不老莓，简称黑果。研究表明，黑果果实具有很高的营养价值和经济价值，尤其是其中的多酚含量是目前已知果实中最高的，每100 g 鲜果中所含的多酚可达2 050 mg 没食子酸当量～2 560 mg 没食子酸当量[1-2]。近年来，随着多酚降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤等多种生理功能的发现[3-7]，有关黑果多酚是生命科学领域研究的热点之一，如高凝轩等[1]和仇洋[5]分别用大孔树脂纯化黑果多酚提高其纯度。由于目前国外对黑果多酚纯化的报道较少，提取物纯度仍较低，不利于对其药用价值及生物活性等进一步的研究，也不利于原料药及功能食品的开发。大孔树脂是一类不溶于酸、碱和各种有机溶剂，具有较好吸附性的有机高分子聚合物[8]，其富集效果明显、解吸条件温和、不受无机物影响、可多次再生、使用周期长，近年来大孔树脂在多酚类活性物质的分离纯化的应用越来越多[9-10]。本文通过考察大孔树脂对黑果多酚的纯化效果，为多酚类物质的进一步研究以及工业化生产提供方法及理论依据。

1 材料与仪器

1.1 试验原料及试剂

黑果腺肋花楸冻果：辽宁华益农业开发有限公司；HPD600 型、S-8 型、HPD450 型、XAD-7型、AB-8型和X-5 型大孔树脂：北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、盐酸和氢氧化钠：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；Folin-Phenol 试剂：北京博奥拓达有限公司。

1.2 仪器与设备

电子天平（YP10002）：上海光正医疗仪器有限公司；振荡水浴锅（B-220）、旋转蒸发器（RE52CS），上海亚荣生化机器厂；循环水式多用真空泵（SHB-ⅢS）：郑州长城科工贸有限公司；紫外光分光光度仪（T6）：北京普析通用仪器有限责任公司；振荡培养箱（HZQF160）：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；电热恒温干燥箱（202-2 型）：上海阳光实验仪器有限公司；pH计（pH-300 型）：上海天达仪器有限公司；真空冷冻干燥机（FD-1C-50）：上海乔跃电子有限公司。

2 试验方法

2.1 黑果多酚粗提液的制备

采用改良的令博等[11]的方法：将黑果解冻后打浆，在乙醇体积浓度60%、液料比1∶20（g/mL）、提取温度50 ℃的条件下提取20 min，抽滤，旋蒸。

2.2 黑果多酚含量和纯度的测定

以没食子酸为标准品，用Folin-Phenol 法[12]测定黑果多酚粗提液中多酚的含量，多酚的纯度经-80 ℃冷冻干燥后参考曹增梅等[13]的方法计算。

2.3 大孔树脂的筛选

称取经预处理[14]的XAD-7、X-5、AB-8、HPD600、S-8 和HPD450 型大孔树脂各5.0 g 分别置于6 个锥形瓶中，每瓶加入50 mL 黑果多酚粗提液，在25 ℃、120 r/min 的条件下恒温振荡静态吸附24 h，量取上清液稀释至适当倍数，在波长760 nm 条件下测定其吸光度值，并计算其吸附量和吸附率；吸附饱和的树脂滤出后用蒸馏水冲洗至无色，吸除多余的水分，再加入50 mL 体积分数为80%的乙醇溶液，用保鲜膜密封瓶口，在25 ℃，120 r/min 的条件下进行静态解吸24 h，量取上清液稀释至适当倍数，测定其吸光度值并计算解吸率。根据吸附率和解吸率选择纯化效果较优的大孔树脂[15]。相关计算公式如下所示：

式中：C0：样品液起始浓度，mg/mL；C1：吸附平衡时多酚溶液浓度，mg/mL；V：样品溶液体积，mL；m：树脂质量，g；C2：解吸液中多酚浓度，mg/mL。

2.4 XAD-7型大孔树脂静态吸附-解吸黑果多酚的动力学曲线的绘制

分别在上述吸附和解吸条件下每0.5 h 取1 mL 上清液测定多酚含量，并绘制静态吸附动力学曲线和静态解吸动力学曲线。

2.5 XAD-7型大孔树脂静态吸附-解吸黑果多酚的影响因素的研究

2.5.1 静态吸附试验

在上述静态吸附条件下，分别考察不同上样液质量浓度（稀释2、3、4、5、6、7 倍）和不同上样液pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）对XAD-7型大孔树脂静态吸附效果的影响。

2.5.2 静态解吸试验

在上述条件下，分别考察不同体积分数乙醇溶液（40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%）和不同乙醇溶液pH值（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）对XAD-7型大孔树脂静态解吸效果的影响。

2.6 XAD-7型大孔树脂动态吸附-解吸黑果多酚的影响因素研究

精确称取一定量（湿重）XAD-7型大孔树脂，湿法装入1.8×40 cm 的层析柱中，填充高度为30 cm，将黑果多酚粗提液以一定流速进行上样，进行动态吸附，吸附完全后用蒸馏水去除上样液中不能被树脂吸附的杂质，最后用95%乙醇溶液进行动态洗脱[16-17]。

2.6.1 上样流速和上样量对XAD-7型树脂吸附效果的影响

多酚上样流速分别设定为1、2、4、8 mL/min 和16 mL/min，收集未能吸附的黑果多酚流出液，测定流出液中多酚的A760nm并计算其含量和吸附量，确定最佳的上样量。

2.6.2 洗脱流速对XAD-7型树脂解吸效果的影响

将黑果多酚粗提液以一定的流速注入层析柱中进行吸附，待树脂吸附饱和后，用95 %乙醇溶液进行动态解吸并调节其流速，洗脱流速设定为1、2、4、8 mL/min 和16 mL/min，收集黑果多酚流出液，测定流出液中多酚的A760nm并计算其含量和解吸率。

2.7 数据分析

采用origin9.0 软件作图，SPSS17.0 统计软件进行数据分析，所有数据均为3 次重复试验结果的平均值，结果表达为平均值±标准偏差。

3 结果与讨论

3.1 大孔树脂的筛选

黑果多酚的大孔树脂静态吸附及解吸效果见表1。

表1 6种大孔树脂对黑果多酚的静态吸附及解吸效果Table 1 The static adsorption and desorption results of six macroporous resins on polyphenols

如表1所示，在所研究的6种大孔树脂中，S-8 和XAD-7型对多酚的吸附效果显著优于其他树脂，AB-8 和XAD-7型的解吸效果显著优于其他树脂。综合各型号树脂的吸附和解吸情况，选用XAD-7型大孔树脂作为黑果多酚的纯化树脂进行下一步研究。

3.2 不同吸附时间下XAD-7型大孔树脂对黑果多酚的静态吸附-解吸效果

大孔树脂对黑果多酚的静态吸附及解吸情况见表2。

如表2所示，随着吸附时间的延长，XAD-7型树脂对黑果多酚的吸附量也逐渐增大；当吸附到2.5 h 时树脂对黑果多酚的吸附量达到了稳定，随后XAD-7型树脂的吸附量增加较为缓慢。随着解吸时间的延长，XAD-7型树脂对黑果多酚的解吸率没有显著变化（p＞0.05）。

表2 XAD-7型大孔树脂对黑果多酚的静态吸附及解吸效果Table 2 The static adsorption and desorption results of XAD-7 macroporous resin on polyphenols

3.3 XAD-7型大孔树脂对黑果多酚静态吸附-解吸条件的影响因素

3.3.1 上样液质量浓度对XAD-7型树脂静态吸附效果的影响

上样液质量浓度对树脂吸附效果的影响见图1。

图1 上样液质量浓度对树脂吸附量的影响Fig.1 The effect of sample concentration on adsorption quantity of resin

如图1所示，当黑果多酚上样液质量浓度为2.67 mg/mL 以下时，随着上样液质量浓度的增加，XAD-7型大孔树脂对多酚的吸附量也随之增加。当上样液质量浓度为2.67 mg/mL 以上时，吸附量下降。造成这种现象的原因是当上样液质量浓度较大时，有少量黑果多酚未被树脂吸附，易产生沉淀，堵塞树脂，造成多酚吸附量的下降；当上样液质量浓度为2.67 mg/mL 以下时，有部分树脂尚未达到饱和，树脂的使用效率较低[18-19]。因此，上样液质量浓度为2.67 mg/mL 左右最佳。

3.3.2 上样液pH值对XAD-7型树脂静态吸附效果的影响

上样液pH值对树脂静态吸附效果的影响见图2。

图2 上样液pH值对树脂吸附量的影响Fig.2 The effect of pH value on adsorption quantity of resin

如图2所示，当黑果多酚上样液pH值在2～4 范围内时，大孔树脂对多酚的吸附量因pH值的増大而显著升高；而上样液pH值在4～7 时，随着pH值的升高，多酚吸附量降低。这是由于上样液pH值的变化，可以改变目标成分在溶液中存在的形式，改变溶液极性，影响目标成分与大孔吸附树脂的分子间作用力。黑果多酚中含有大量酚羟基，呈酸性，在酸性条件下比较稳定，从而利于大孔树脂对多酚的吸附[1]。

3.3.3 洗脱剂乙醇体积分数对XAD-7型树脂静态解吸效果的影响

洗脱剂的体积分数对树脂静态解吸率的影响见图3。

图3 洗脱剂体积分数对树脂解吸率的影响Fig.3 The effect of eluent concentration on desorption rate of resin

如图3所示，随着洗脱剂乙醇体积分数的增大，多酚的解吸率也随之提高，当乙醇体积分数达到95%时，解吸率最高。这是由于洗脱剂和相应的洗脱剂体积分数对大孔树脂的选择遵循相似相溶的原理[20]。XAD-7型大孔树脂属于弱极性的树脂，而本试验所选的乙醇洗脱剂中，95%乙醇溶液的极性最小，所以其效果最好。因此，选用95%乙醇溶液作为洗脱剂。

3.3.4 洗脱剂的pH值对XAD-7型树脂静态解吸效果的影响

洗脱剂pH值对树脂静态解吸效果的影响见图4。

图4 洗脱剂pH值对树脂解吸率的影响Fig.4 The effect of pH value of eluent solution on desorption rate of resin

如图4所示，乙醇溶液pH值在2.0～7.0 范围内，随着pH值的升高黑果多酚解吸效果明显增强；在pH值为7.0 时达到最大值，解吸率高达88.48%；当pH值大于7.0 时，解吸效果随pH值增加呈下降趋势。因此，洗脱剂最佳的pH值为7.0。

3.4 XAD-7型树脂对黑果多酚的动态吸附-解吸的影响因素

3.4.1 黑果多酚的上样流速和上样量对XAD-7型树脂吸附的影响

上样流速和上样量对树脂吸附效果的影响如图5所示。

图5 上样流速对树脂吸附效果的影响Fig.5 The effect of different flow rates on the adsorption of resin

由图5可知，在上样液浓度为2.76 mg/mL、上样流速为1、2、4、8 mL/min 和16 mL/min 时，泄漏点发生在吸附量分别为430、390、330、290、210 mL 附近；当流速为1 mL/min 时，树脂吸附量最大。随着上样液体积的增加，流出液中多酚的浓度逐渐增大。上样流速过快时，会使得黑果多酚没有足够的时间被大孔树脂吸附，导致吸附效果降低。当流出液中多酚浓度达到上样液多酚质量浓度的1/10 时，被认为已经产生泄漏[5]。在动态吸附过程中，当层析柱中树脂吸附多酚样液开始出现泄漏时，终止吸附，此时为吸附的最佳状态[21]。因此，选择上样流速为1 mL/min，上样量为430 mL。

3.4.2 洗脱剂乙醇溶液的洗脱流速对XAD-7型树脂解吸效果的影响

乙醇溶液的洗脱流速对树脂洗脱效果的影响如图6所示。

图6 乙醇溶液的洗脱流速对树脂洗脱效果的影响Fig.6 The effect of elution flow rate of ethanol solution on the elution of resin

在吸附条件相同的情况下考察不同洗脱流速对XAD-7型大孔树脂解吸效果的影响。由图6可知，洗脱液以1 mL/min 进行洗脱得到的峰形相对较窄且拖尾状况不显著，以2、4、8 mL/min 和16 mL/min 进行洗脱得到的峰形较宽且拖尾状况比较显著，因此选择洗脱流速为1 mL/min 最为合适，此流速条件下洗脱体积为210 mL。在此条件下计算多酚纯度由9.56%提高到74.26%。

4 结论

通 过 对 比XAD-7、X-5、AB-8、HPD600、S-8、HPD450 型大孔树脂对黑果多酚吸附-解吸的效果发现，XAD-7型大孔树脂能够较好的纯化黑果多酚，其最佳静态吸附-解吸工艺条件为：上样液质量浓度2.76 mg/mL，上样液pH值4.0，吸附时间2 h；洗脱剂乙醇体积分数95 %，pH值7.0，解吸时间1 h。最佳动态吸附-解吸工艺条件为：上样量430 mL，上样流速1 mL/min，洗脱体积210 mL，洗脱流速1 mL/min。在此条件下，黑果多酚提取物纯度由9.56 %提高到74.26 %，表明XAD-7型大孔树脂能够较好地纯化黑果多酚。