情景记忆及恐惧记忆消退与再次建立的关联性

姚慧慧， 张平平, 王烈成

学习记忆是中枢神经系统的一项重要的高级生命活动。巴甫洛夫经典条件反射模型以及在此基础上发展出来的情景条件反射是最常用来研究动物恐惧记忆的动物模型。将声、光等中性刺激与厌恶性足部电击非条件化刺激(unconditioned stimulus, US)配对呈现。两种刺激重复配对，使条件化刺激获得抑价，条件化个体形成联合性记忆，称为条件化刺激(conditioned stimulus, CS)，使有着对US的厌恶性恐惧的个体对后续呈现的CS或者训练场景产生恐惧反应。按照CS的来源不同，可以分为线索性恐惧条件化(声、光、气味等引起)和场景性恐惧条件化(情景引起)[1-3]。条件化恐惧消退是指条件化恐惧情绪建立之后，仅重复呈现CS而无US，则己建立的恐惧情绪逐渐减弱甚至消失，该过程简称恐惧消退[4]。该研究的实验设计方法可以短时间内进行恐惧记忆的建立与抹除，同时可以观测到情景记忆在此期间的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物成年昆明正常小鼠 20 只，雄性，体质量18～22 g，月龄、体质量等差异无统计学意义。由安徽医科大学实验动物中心提供。实验动物实行单笼饲养，饮食自由，饲养温度在25 ℃左右，保持环境干燥通风。

1.2方法

1.2.1非条件刺激的最佳刺激持续时间与刺激强度探索 非条件刺激由连续两次相同的足底电击组成，两次电击的间隔时间为2 s。探索条件：0.04 mA，持续8 s；0.05 mA，持续6 s；0.06 mA，持续4 s。通过 ZH-KJ型场景恐惧实验系统(安徽正华生物仪器设备有限公司)检测小鼠在不同刺激强度与时间组合下的木僵行为，从而确定最佳刺激强度与时间。然后探索最佳条件刺激：使用三种频率(1、1.5、2 kHz)的铃声(声压为75 dB，时长30 s)分别与非条件刺激配对，重复5次(每组条件刺激与非条件刺激的间隔时间为3 s)，观测条件刺激建立的难易程度，从而选择一种最佳铃声作为条件刺激。实验前先将小鼠放入实验环境中让其自由活动以适应环境10 min，小鼠被放进去之前要用70%乙醇进行消毒以消除前一只小鼠气味的影响。

1.2.2恐惧记忆的建立 将小鼠放入方形笼中，给予其30 s由最佳背景铃声作为条件刺激，非条件刺激紧随其后(间隔3 s的重复5次刺激，每次刺激持续时间3 s)。该联合刺激每隔5 min给予1次，共给予10次。小鼠出现的木僵反应通过红外光探测系统进行监测，当小鼠在2 s内没有发生移动则被认定为出现了木僵行为，用木僵时间来量化。统计分析每次刺激过程中小鼠的木僵时间 。

1.2.3不改变周边环境条件下恐惧记忆的抹除 在方形笼中小鼠建立恐惧记忆后，只给予条件刺激30 s，不伴有非条件刺激，条件刺激的间隔时间为60 s，总共进行10～20次的条件刺激。观察记录每次条件刺激中小鼠出现的木僵时间，统计分析木僵时间变化规律，直至小鼠的木僵现象消失。

1.2.4改变周边环境条件下恐惧记忆的抹除 将在方形笼中建立恐惧记忆的小鼠放入圆柱体笼中，只给予条件刺激30 s，不伴有非条件刺激，条件刺激的间隔时间为60 s，总共进行10～20次的条件刺激。观察记录每次条件刺激中小鼠出现的木僵时间，统计分析木僵时间变化规律，直至小鼠的木僵现象消失。

1.2.5不改变周边环境条件下恐惧记忆的再次建立 将1.2.3 不改变周边环境条件下恐惧记忆的抹除中已抹除恐惧记忆的小鼠再次按照1.2.2 恐惧记忆建立的条件进行实验观察，记录统计分析每次刺激过程中小鼠的木僵时间 。

1.2.6实验流程图 见图1。

2 结果

2.1恐惧记忆最佳实验条件的确定首先探索最佳非条件刺激，主要是通过不断调整足底电击的强度与电击时间的组合。本实验中主要涉及三种组合非条件刺激(0.04 mA，持续8 s；0.05 mA，持续6 s；0.06 mA，持续4 s)。统计结果(图2A)可以看出经第二种非条件刺激(0.05 mA，持续6 s)的小鼠在第三次刺激以后，小鼠僵立次数明显高于其他组合，且随着电刺激次数的增加这种差别越明显。以非条件刺激(0.05 mA，持续6 s)为基础与条件刺激进行配对，此时主要通过改变条件刺激中的声音频率(1、1.5、2 kHz)来确定最佳条件刺激。统计结果(图2B)可以看出，当声音频率为1.5 kHz时，小鼠的恐惧记忆更容易形成。因此，最终本实验采取的最佳实验刺激条件，其中非条件刺激为0.05 mA足底电击和持续时间6 s；条件刺激为75 dB铃声，频率1.5kHz，持续时间30 s。

图1 实验流程图

图2 最佳非条件刺激和条件刺激参数的实验统计结果

2.2恐惧记忆的形成与巩固给予小鼠条件刺激与非条件刺激的联合，这些小鼠第1次 声音刺激僵立的时间和次数分别为(0.29 ± 0.25) s和(0.25 ± 0.22)次，并随训练次数增加而逐步递增，至第6次分别为(8.90 ± 2.54) s和(2.00 ± 0.50)次，明显高于第1次条件刺激(P<0.05)，说明恐惧记忆形成，同时随着第3次以后的训练此种恐惧记忆逐渐被巩固。见图3。

图3 恐惧记忆的形成与巩固的实验统计结果

2.3不改变周边环境，恐惧记忆的抹除过程在已形成恐惧记忆的小鼠，不改变周边环境，仅给予条件性声音刺激，第1次 声音刺激僵立的时间和次数分别(27.94 ± 1.16) s和(8.75 ± 0.22)次，并随消退训练次数增加而逐步递减，至第3和第4次分别为(20.05 ± 2.26) s和(3.5 ± 0.75)次，显著性低于第1次条件刺激(P<0.05)，说明恐惧记忆逐渐被抹除。见图4。

图4 不改变周边环境下恐惧记忆的抹除的实验统计结果

2.4改变周边环境，恐惧记忆的抹除过程在已形成恐惧记忆的小鼠，改变周边环境，仅给予条件性声音刺激，第1次 声音刺激僵立的时间和次数分别为(24.55 ± 4.03) s和(6.75 ± 0.74)次，并随消退训练次数增加而逐步递减，至第3和第4次分别为(12.85 ± 2.44)s和(4.00 ± 0.61)次，明显低于第1次条件刺激(P<0.05)，说明恐惧记忆逐渐被抹除。见图5。

2.5不改变周边环境下恐惧记忆的再次建立过程小鼠在已形成恐惧记忆后，并如结果2.2抹除其恐惧记忆。在相同的环境下在给予小鼠条件刺激与非条件刺激的联合，这些小鼠第1次 声音刺激僵立的时间和次数分别为(0.28 ± 0.24) s和(0.25 ± 0.22)次，并随训练次数增加而逐步递增，至第3次分别为(2.59 ± 0.46) s和(1.5 ± 0.25)次，明显高于第1次条件刺激(P<0.05)，说明恐惧记忆再次形成。见图6。

图5 改变周边环境下恐惧记忆抹除的实验统计结果

图6 不改变周边环境下恐惧记忆再次形成与巩固的实验统计结果

3 讨论

3.1对于恐惧记忆条件反射的建立与消除所需时间相对较短作为经典式条件反射行为，眨眼条件反射、恐惧条件反射都是常用的联合型学习记忆模型，联合学习指个体对不同时间发生的事件进行联系并从行为上表达出来。但是一般经典的条件反射过程建立的时间比较久，例如眨眼条件反射。然而作为条件反射的恐惧记忆的建立所需时间相对短得多。通过本实验的探究方法，小鼠在配对给予 CS与US 的第6次声音刺激即可成功进行初次恐惧记忆的建立，而不改变周边环境再次进行恐惧记忆的建立仅需3次声音刺激。至于恐惧记忆的抹除，不改变周边环境需要4次声音刺激，改变周边环境在第3次声音刺激时就可以成功抹除。同时，通过小鼠不同的实验阶段的僵立时间的比较也与僵立次数的变化规律相同。

3.2实验方法便于学生教学，但仍需进一步完善由于学生实验时间的限制，需短时间内形成条件反射的建立与消退以及观测情景记忆与条件反射抹除的关联性，本研究的整个实验时间可以控制在3 h之内，通过此实验便于学生理解和解释临床中治疗患者心理恐惧疾病的原理。但是此实验探究方法的难点在于：在较短的时间内形成条件反射和条件反射抹除；区分条件反射抹除与情景记忆的关联性；统计分析实验中再次建立的条件反射和正常形成条件反射的时间及其差异。

3.3探究情景记忆与恐惧记忆抹除的关联性行为学研究[5-7]表明，在联结式学习中情景确实扮演了一定的角色。情景可以作为一个由内部和外部感觉输入结合的复杂线索，它直接影响到结果的正负性，例如在恐惧条件反射的形成过程。情景不仅有调节作用，而且可以推动线索与结果关联的检索，就像以前已经抹除的恐惧反应可以再次更新[ 5, 8]。情景记忆在条件反射中所起到的作用已有报道，但是对于短时间内采用具体的行为学实验来观测其在条件反射的建立与抹除过程中的作用未见具体报道。本研究的结果提示，情景记忆在条件反射的抹除过程中起一定的促进作用，即改变生活的周边环境下，对已经形成的恐惧记忆抹除更加容易。

3.4情景记忆在临床中对于恐惧记忆抹除的作用通过对情景记忆在恐惧记忆抹除关联性的认识，有助于理解在临床治疗恐惧记忆或心灵创伤时，医生经常采取改变患者产生恐惧记忆或心灵创伤的情景，以便更快地帮助患者抹除痛苦的记忆。如学生在校期间受到很严重的心灵创伤后的转学，丧偶后暂时离开居住地以减弱丧偶之痛等。

3.5对于内在的神经机制有待于进一步深入研究对于恐惧记忆的听觉CSs和情景的获取和表达，杏仁核起到了重要的作用[9]。从解剖学上讲，杏仁核可以分为基底外侧杏仁核(BLA)，包括外侧(LA)、基底(BA)和副基底(BMA)核，以及中央杏仁核(CEA)，由外侧(CEl)和内侧(CEm)组成。BLA接收到直接的皮质和丘脑感觉输入并与许多前脑结构相连接包括内侧前额叶皮质(mPFC)和海马体[9]。CEA投射出下丘脑和中脑结构关于条件恐惧反应的表达[10-11]。海马不仅可以对情景化信息进行加工，而且对于情景化的恐惧条件反射的行成以及恐惧记忆的线索检索有着重要意义[ 12-13]。 正是由于中枢神经系统对恐惧记忆有很大的影响，使得恐惧记忆虽然可以短时间内被抹除，但是再次建立很容易。本研究结果表明不改变周边环境，条件反射的再次建立过程中第3次声音刺激便能再次建立，与初次建立需要的第6次缩短一半时间。不难看出小鼠的恐惧记忆再次建立非常迅速。这说明条件反射一旦建立，即使由于长时间不加强而遗忘后，再次强化要比首次建立要容易得多，对于此神经机制值得深入研究。