蛋白激酶抑制剂LY333531对大鼠烟雾吸入性肺损伤氧化应激的影响

程 浩,宋立成, 奂剑波, 陈丽娜, 陈旭昕, 韩志海

烟雾吸入后，其固有的高温及富含有毒有害颗粒等特性可导致气管及肺实质的直接和间接损害，从而引发烟雾吸入性肺损伤(smoke inhalation induced acute lung injury, SI-ALI)。火灾中若合并有烟雾吸入性肺损伤，死亡率将上升至60%～80%[1]。烟雾吸入后，氧化应激的加强对肺损伤的加重起着重要作用[2]。近年来学者发现激活PKC β/P66Shc信号通路会加强机体氧化应激，致使机体损伤加重[3-4]。而特异性PKC β抑制剂LY333531能够抑制该通路激活，减少机体氧化应激的损伤。目前，已有研究证实，应用LY333531后能有效减轻高氧刺激对细胞的损伤[5]。但是，在烟雾吸入性肺损伤中，LY333531是否能够通过抑制PKC β/P66Shc信号通路进而减轻氧化应激损伤，尚不明确。因此，本实验拟通过建立SD大鼠烟雾吸入性肺损伤模型，探究LY333531能否减轻烟雾吸入后肺组织的氧化应激损伤。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组40只体质量为(200±10)g的健康雄性SPF级SD大鼠由军事医学科学院动物实验中心提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0002，大鼠随机分成4组:空白对照组(吸入空气+无干预)、抑制剂对照组(吸入空气+LY333531干预)、烟雾吸入组(吸入烟雾+无干预)、烟雾吸入+抑制剂组(吸入烟雾+LY333531干预)，每组各10只大鼠。实验方案通过海军总医院动物伦理委员会批准。

1.2实验仪器自制产烟箱、集烟箱(产烟箱与集烟箱用管道联通，产烟箱一侧有排风扇)；产烟用电炉(兴化市楚水电热电器厂)；电热恒温干燥箱(上海上迈电子仪器有限公司)；泵吸式四合一气体检测仪(加拿大BW公司)；低温离心机、酶标仪、微量移液器(美国Thermo公司)；一次性采血针(江苏治宇医疗器材有限公司)；真空采血管等[北京积水医疗科技(中国)有限公司]。

1.3实验试剂MDA试剂盒、NOS试剂盒、SOD试剂盒、CAT试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Anti-SHC抗体[EP332Y]、Anti-SHC(phospho S36)抗体[6E10](英国Abcam公司)；GAPDH抗体(美国CST公司)；ECL超敏发光液(北京索莱宝科技有限公司)蛋白酶抑制剂LY333531(美国CST公司)；二甲基亚砜(德国Applichem公司)等。

1.4实验方法

1.4.1实验动物预处理 抑制剂对照组大鼠及烟雾吸入+抑制剂组大鼠在进行烟雾实验前1周按1 mg/(kg·d)[6]腹腔注射蛋白酶抑制剂LY333531。空白对照组与烟雾吸入组均无干预。四组大鼠均按正常饮食饲养。

1.4.2实验动物模型建立 本实验选用室内火灾中常见的易燃材料发泡橡塑绝热制品、阻尼材料、电缆线、硅丙乳胶漆等混合材料作为产烟材料。将各种产烟材料(各10 g)粉碎后充分混匀置于产烟箱中的电磁炉托盘上，封闭产烟箱，将电磁炉通电，加热维持炉丝温度300 ℃。待烟雾充满产烟箱后，打开排风扇将烟雾吹向集烟箱中，监测集烟箱中气体成分及浓度，利用排风扇控制集烟箱中CO:300～500 ppm，H2S:10～15 ppm,O2:20%～21.9%。将预处理完毕的烟雾吸入组和烟雾吸入+抑制剂组SD大鼠置于集烟箱中，封闭集烟箱，稳定吸入25 min。25 min后将实验大鼠移出烟雾环境置于正常环境。空白对照组与抑制剂对照组也放入集烟箱中吸入空气25 min。观察各组大鼠呼吸、心跳、精神状态，记录大鼠死亡率。

1.4.3实验动物处理 各组SD大鼠在吸入处理后正常食水喂养12 h，12 h后各组SD大鼠腹腔注射戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉后解剖。

1.4.4实验动物标本采集 实验大鼠麻醉后开腹，于腹主动脉抽取5 ml动脉血置于真空采血管中，随后置于离心机中，3 500 r/min离心10 min后取上清液置于EP管中于-80 ℃冰箱中冻存以备后用。抽取动脉血后放血处死大鼠，随后开胸、结扎气管，取出肺组织，结扎右肺，用生理盐水对左肺行肺泡灌洗，收集约1 ml BALF 3 500 r/min离心10 min后取上清液置于EP管中于-80 ℃冰箱中冻存以备后用。随后分离右肺各叶；右肺上叶称重后置于60 ℃恒温箱中烘干至质量不再改变后再称重，检测其湿干比(W/D);右肺中叶取出后置于EP管中于-80 ℃冰箱中冻存以备后用；右肺下叶取出后迅速放入4%多聚甲醛溶液中固定，24 h后进行石蜡包埋，HE染色，光镜下观察肺组织病理学改变。

1.4.5肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中蛋白浓度测定 将收集的BALF采用BCA法检测肺泡灌洗液中的蛋白浓度，检测方法按照BCA蛋白试剂盒(美国Thermo公司)说明书进行。

1.4.6肺组织匀浆及血清中丙二醛(malondialdehyde, MDA)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)浓度测定 将取出的右肺中叶研磨制成肺组织匀浆以及收集的血清分别按照各自试剂盒说明书操作检测肺组织匀浆和血清中反映氧化应激的MDA、NOS、SOD、CAT。

1.4.7Western blot方法检测肺组织匀浆中P66Shc及磷酸化P66Shc蛋白表达情况 将上述取出的右肺中叶取出0.1 g与1 ml裂解液混合后研磨制成肺组织匀浆，应用BCA法检测蛋白浓度，随后按lodding buffer ∶肺组织匀浆液=1 ∶3比例制成蛋白样本，加样后于10%的丙烯酰胺凝胶分离蛋白，60 mA湿转3 h至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭1 h，适量稀释比例的一抗P66Shc(1 ∶1 000)、磷酸化P66Shc(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜，1×TBST洗膜3次，二抗室温孵育(1 ∶10 000)1 h，1×TBST洗膜3次，ECL化学显影，运用Image J软件对Western blot结果行半定量灰度值分析。

2 结果

2.1实验大鼠呼吸、心率、精神状态及死亡率与空白对照组、抑制剂对照组相比，烟雾吸入组与烟雾吸入+抑制剂组大鼠在烟雾吸入25 min后，呼吸频率、心率明显加快。接受吸入处理后至解剖处理前，烟雾吸入组大鼠死亡3只(3/10)，烟雾吸入+抑制剂组大鼠死亡2只(2/10)。空白对照组与抑制剂对照组大鼠无死亡。成活大鼠中，烟雾吸入组和烟雾吸入+抑制剂组大鼠精神萎靡，烦躁，偶有呃逆现象出现。置于正常环境后，上述现象逐渐好转，在吸入处理3 h后大鼠精神状态恢复。

2.2BALF蛋白浓度与空白对照组相比，抑制剂对照组BALF浓度无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，与空白对照组、抑制剂对照组比较，烟雾吸入组和烟雾吸入+抑制剂组BALF中蛋白浓度均明显上升，差异有统计学意义(P<0.05),与烟雾吸入组比较，烟雾吸入+抑制剂组BALF蛋白浓度减少，差异有统计学意义P<0.05)。见表1。

2.3肺组织W/D比较与空白对照组比较，抑制剂对照组W/D无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组、抑制剂对照组比较，烟雾吸入组与烟雾吸入+抑制剂组肺组织W/D均上升(P<0.05)，其中，烟雾吸入组大鼠肺组织W/D上升更明显；与烟雾吸入组比较，烟雾吸入+抑制剂组大鼠肺组织W/D有所下降(P<0.05)。见表1。

2.4肺组织匀浆MDA、NOS、SOD、CAT

2.4.1MDA 与空白对照组比较，抑制剂对照组肺组织匀浆中MDA无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组、抑制剂对照组比较，烟雾吸入组与烟雾吸入+抑制剂组肺组织匀浆中MDA均升高(P<0.05)；与烟雾吸入组比较，烟雾吸入+抑制剂组大鼠肺组织MDA有所下降(P<0.05)。见表2。

2.4.2总一氧化氮合酶(total nitric oxide synthase，TNOS)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS) 与空白对照组比较，抑制剂对照组大鼠肺组织匀浆TNOS和iNOS无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组、抑制剂对照组比较，烟雾吸入组大鼠和烟雾吸入+抑制剂组大鼠肺组织匀浆中TNOS和iNOS均上升(P<0.05)；与烟雾吸入组比较，烟雾吸入+抑制剂组TNOS与iNOS均未见明显减少，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.4.3SOD 与空白对照组比较，抑制剂对照组大鼠肺组织匀浆SOD活力无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组、抑制剂对照组比较，烟雾吸入组及烟雾吸入+抑制剂组大鼠SOD活力明显下降(P<0.05)；与烟雾吸入组比较，烟雾吸入+抑制剂组大鼠SOD活力有所上升(P<0.05)。见表2。

2.4.4CAT 与空白对照组比较，抑制剂对照组大鼠肺组织匀浆CAT活性无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组、抑制剂对照组比较，烟雾吸入组及烟雾吸入+抑制剂组大鼠CAT活性明显下降(P<0.05)；与烟雾吸入组比较，烟雾吸入+抑制剂组CAT活性未见明显增加，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组大鼠BALF蛋白浓度、肺组织W/D结果

与空白对照组比较：*P<0.05;与抑制剂对照组比较：#P<0.05; 与烟雾吸入组比较：△P<0.05

表2 各组大鼠肺组织匀浆MDA、NOS、SOD、CAT结果

与空白对照组比较：*P<0.05;与抑制剂对照组比较：#P<0.05; 与烟雾吸入组比较：△P<0.05

表3 各组大鼠血清MDA、NOS、SOD、CAT结果

与空白对照组比较：*P<0.05;与抑制剂对照组比较：#P<0.05; 与烟雾吸入组比较：△P<0.05

2.5血清MDA、NOS、SOD、CAT

2.5.1MDA 与空白对照组比较，抑制剂对照组血清中MDA无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组、抑制剂对照组比较，烟雾吸入组与烟雾吸入+抑制剂组血清中MDA浓度均增加(P<0.05)；与烟雾吸入组比较，烟雾吸入+抑制剂组大鼠血清MDA有所下降(P<0.05)。见表3。

2.5.2TNOS和iNOS 与空白对照组比较，抑制剂对照组血清中TNOS、iNOS无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组、抑制剂对照组比较，烟雾吸入组大鼠和烟雾吸入+抑制剂组大鼠血清中TNOS和iNOS均明显上升(P<0.05)；与烟雾吸入组比较，烟雾吸入+抑制剂组TNOS，iNOS水平下降(P<0.05)。见表3。

2.5.3SOD 与空白对照组比较，抑制剂对照组血清SOD活力无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组、抑制剂对照组比较，烟雾吸入组及烟雾吸入+抑制剂组大鼠血清中SOD活力明显下降(P<0.05)；与烟雾吸入组比较，烟雾吸入+抑制剂组大鼠血清SOD活力升高(P<0.05)。见表3。

2.5.4CAT 与空白对照组比较，抑制剂对照组血清CAT活性无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)；与空白对照组和抑制剂对照组比较，烟雾吸入组及烟雾吸入+抑制剂组大鼠血清中CAT活性明显下降(P<0.05)；与烟雾吸入组比较，烟雾吸入+抑制剂组大鼠血清中CAT活性增加(P<0.05)。见表3。

2.6肺组织匀浆P66Shc、磷酸化P66Shc表达Western blot显影结果显示空白对照组与抑制剂对照组P66Shc蛋白表达较低，烟雾吸入组大鼠肺组织P66Shc蛋白表达明显增加，烟雾吸入+抑制剂组较烟雾吸入组有所减轻。而活化后的磷酸化P66shc,抑制剂对照组表达明显低于空白对照组，而烟雾吸入组与烟雾吸入+抑制剂组表达明显上升。运用Image J软件对显影结果行灰度值分析可见，与空白对照组比较，抑制剂对照组p-P66Shc/P66Shc比值明显下降(P<0.05),烟雾吸入组p-P66Shc/P66Shc比值则明显上升(P<0.05)；烟雾吸入+抑制剂组p-P66Shc/P66Shc比值明显上升(P<0.05)；与烟雾吸入组比较，烟雾吸入+抑制剂组p-P66Shc/P66Shc比值上升(P<0.05)，见图1。

图1 Western blot检测各组大鼠肺组织P66Shc及p-P66Shc蛋白表达情况

2.7肺组织病理学特征光镜下可见空白对照组与抑制剂对照组肺泡结构完整，肺泡间隔正常，肺泡腔内可见少许炎性细胞浸润。烟雾吸入组肺泡结构遭到破坏，出现肺泡断裂，肺泡间隔明显增厚，肺泡腔内大量炎性细胞浸润以及粉红色液体渗出。烟雾吸入+抑制剂组肺泡结构相对完整，肺泡间隔增厚，肺泡腔内有炎性细胞及红色渗出物出现，与烟雾吸入组相比，损伤较轻。见图2。

图2 肺组织病理HE染色 HE×400

3 讨论

合并烟雾吸入是火灾中死亡最主要的原因。而氧化应激在烟雾吸入性肺损伤中也占据着重要地位，其中，脂质过氧化、i NOS过表达引起的肺水肿、抗氧化相关酶的大量消耗等均是机体损伤的重要原因[2]。烟雾吸入后，刺激引起机体产生过多的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)，而机体内大部分ROS需通过抗氧化酶SOD、CAT等还原成无氧化毒性的水，从而保证机体氧化还原平衡[7-8]。活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)的过多表达则是由于烟雾吸入后，机体内的iNOS显著增多，iNOS分解L-精氨酸产生远超过生理剂量的NO，进而加重机体氧化应激损伤[9]；故机体内的氧化还原酶常用来反映机体氧化应激的水平。PKC β/P66Shc信号通路的激活是机体氧化应激加强的重要因素，LY333531是特异性蛋白激酶(PKC β)抑制剂，能抑制PKC β/P66Shc信号通路的激活，减轻机体氧化应激[3,10]。本实验显示烟雾吸入后，大鼠BALF蛋白浓度、W/D、MDA、NOS明显增加，SOD、CAT明显减少，而预防注入LY333531后则有所缓解，可说明烟雾吸入后机体氧化应激加重，而LY333531可减轻烟雾吸入性肺损伤大鼠的氧化应激水平，进而减轻机体损伤。

衔接蛋白P66Shc是机体调控凋亡与调节氧化应激的重要蛋白，正常情况下，P66Shc处于失活状态，主要定位于细胞质。当机体接受外源性刺激或内源性刺激时，PKC/P66SHC信号通路被激活，该蛋白发生构象改变，并转移至线粒体中，并在线粒体内氧化细胞色素C使电子不能顺利传递至复合体IV 形成H2O，而是形成ROS(H2O2)[11]。蛋白激酶抑制剂LY333531能够抑制PKC β/P66Shc信号通路的激活，有研究[12]表明运用该抑制剂能通过抑制NADPH氧化酶，增加SOD的表达减轻糖尿病肾病大鼠模型中氧化应激的肾损害；也有学者研究发现LY333531能减少大鼠心肌组织的氧化损伤，进而发挥其心脏保护作用[13]。本实验Western blot结果显示,烟雾吸入后，大鼠肺组织P66Shc及活化后的p-P66Shc蛋白表达明显增多，而烟雾吸入+抑制剂组则表达相对较少。行灰度值分析时，发现烟雾吸入+抑制剂组p-P66Shc与P66Shc灰度值比值高于烟雾吸入组，这可能是因为烟雾吸入组P66Shc表达远高于烟雾吸入+抑制剂组，而不是因为后者活化p-P66Shc表达更多。结合上述W/D、BALF浓度、氧化还原酶结果及肺组织病理特点。课题组推断：烟雾吸入后，大鼠体内PKC β/P66Shc信号通路激活，下游P66Shc蛋白表达增多，并且活化的磷酸化P66Shc蛋白表达也明显增多，进入线粒体后阻断氧化呼吸链传递，产生过多的H2O2，使得ROS含量明显上升，同时烟雾刺激使得iNOS表达增多，进而体内NO含量明显上升，最终加重大鼠机体的氧化应激损伤。随着ROS的增加，大量脂质过氧化产物MDA聚集，并且消耗体内原有的抗氧化酶SOD、CAT等，使得机体损伤进一步加重。蛋白激酶抑制剂LY333531能特异性抑制PKC β/P66Shc信号通路的激活,使P66Shc活化减少，导致ROS、RNS产生减少，最终使得机体氧化应激减轻，肺水肿、渗出等损伤随之减轻。