五味子乙素通过诱导线粒体自噬减轻心肌缺血再灌注损伤

卢长青，贾合磊，雷 震，王 娟，任冬冬，杨敏华，陈亚奇

急性心肌梗死是导致临床心血管病人死亡的主要原因[1]。目前，利用手术和药物快速有效地恢复冠脉血流是治疗缺血性心血管病的主要方法[2]。但心肌恢复血流灌注的同时又会造成心肌缺血再灌注(myocardial ischemia/reperfusion, MI/R) 损伤，使心肌损伤进一步加重[3]。MI/R损伤涉及多个细胞及分子机制，如氧化应激、炎症反应、钙超载及线粒体自噬等[4-5]。研究[6]表明，线粒体自噬在MI/R损伤过程中发挥着重要的作用，线粒体自噬功能紊乱可加重小鼠MI/R损伤。五味子乙素 (schisandrin B, Sch B)是中药五味子的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化及抗癌等活性，还可减轻小鼠MI/R损伤[7]。但Sch B能否通过调控线粒体自噬减轻小鼠MI/R损伤还有待进一步研究。因此，该文复制MI/R小鼠模型以探究Sch B对MI/R损伤的作用及其机制，以期为Sch B的临床应用提供实验支撑。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器Sch B标准品购自上海哈灵生物科技公司；乳酸盐脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶 (creatine kinase, CK) 和HE染色试剂盒购自北京中山生物技术公司；TRIzol试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司；Beclin1、低氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)、 一抗及HRP标记的山羊抗小鼠二抗购自美国Santa Cruz公司；小鼠呼吸机及心电图仪购自成都太盟仪器公司；低温离心机购自美国ThermoFisher公司。

1.2动物分组及模型建立60只3月龄雄性清洁级C57B/6J小鼠 (18～22 g) 由新乡医科大学实验动物中心提供。饲养环境维持在室温23 ～25 ℃内，湿度65%，12 h明暗交替，自由饮食和进水。适应性饲养3 d后进行实验。将小鼠随机分为Sham组、Sham+Sch B组、MI/R model组和MI/R model+Sch B组，用戊巴比妥钠(80 mg/kg) 麻醉小鼠，仰卧位固定，连接肢体心电图电极和呼吸机(呼吸频率为60～70次/min)，记录Ⅱ导联心电图，分离左侧冠状动脉，Sham组和Sham+Sch B组小鼠结扎左冠状动脉前降支，MI/R model组和MI/R model+Sch B组小鼠结扎左冠状动脉前降支45 min，随后松开结扎线再灌注2 h。以缺血时局部心肌组织苍白或发绀，心电图ST段持续抬高，再灌注时心肌变红润且ST段下降视为造模成功。模型复制成功后，Sham+Sch B组和MI/R+Sch B组小鼠每天灌胃给予Sch B (80 mg/kg/d)，Sham组和Sham+Sch B组小鼠每天给予等量溶媒(无菌水)，连续灌胃30 d后处死小鼠进行后续实验。

1.3AMPK-β1基因缺陷小鼠实验所用到的45只SPF级腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase-β1, AMPK-β1) 基因敲除(AMPK-β1-/-) C57BL/6J雄性小鼠和15只SPF级野生型C57BL/6J雄性小鼠均由中国医学科学院动物研究所提供，小鼠体质量为18～20 g。将小鼠饲养于SPF级环境下，自由进食，光照时间12 h，温度25 ～27 ℃。以15只野生型(wild type, WT) 小鼠为Sham组，AMPK-β1-/-小鼠分为AMPK-β1-/- Sham组、AMPK-β1-/- MI/R model组和AMPK-β1-/- MI/R model+Sch B组。AMPK-β1-/- MI/R model组和AMPK-β1-/- MI/R model+Sch B组小鼠按照上述实验方法复制MI/R模型，Sham组和AMPK-β1-/- Sham组处理则同上述Sham组处理方法相同。模型复制成功后，AMPK-β1-/- MI/R model+Sch B组灌胃给予Sch B，连续30 d，其余组灌胃给予等量溶媒。

1.4血清LDH和CK含量的测定给予受试物30 d后，进行摘眼球取血收集小鼠血液。将所收集血液室温静置1 h后，以3 000 r/min的转速4 ℃离心15 min，取上层血清根据试剂盒说明书检测各组小鼠血清LDH和CK的含量。

1.5心肌梗死面积的检测给予受试物30 d后，处死小鼠，取出心脏。垂直于心脏长轴，由心尖向底部进行切片，共5片。将切片置于37 ℃、pH为7.4的TTC溶液中染色15 min，再用4%多聚甲醛固定。正常心肌颜色为红色，缺血心肌颜色为灰白色，计算心肌梗死面积并进行统计分析。

1.6HE染色取心肌组织，用4%多聚甲醛固定过夜后，用不同浓度酒精进行梯度脱水，二甲苯进行透明，随后将组织置于石蜡中，制作石蜡切片。最后根据HE染色试剂盒对组织切片进行HE染色。

1.7qRT-PCR根据TRIzol试剂盒说明书提取各组小鼠心肌组织总RNA。用逆转录试剂盒合成cDNA，荧光定量PCR试剂盒检测cDNA含量，用2-△△Ct法对数据进行定量分析。实验所用到的引物均由Qiagen公司设计合成。环氧化酶Ⅰ(cyclooxygenase Ⅰ, COXⅠ)上游引物：CACATGAGCAAAAG CCCACT，下游引物：ACGGCCGTAAGTGAGATGAA；环氧化酶Ⅳ(cyclooxygenase Ⅳ, COX Ⅳ)上游引物：GACTACCCCTTGCCTGATGT，下游引物： ACACGTAGCTCTTT CCCAG。

1.8Westernblot用RIPA裂解液提取各组小鼠心肌组织总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。将蛋白浓度调平后，用10% SDS-PAGE将蛋白质分裂并转移至PVDF膜。用5% 脱脂牛奶室温封闭PVDF膜2 h，2 h后加入一抗 (HIF-1α，1 ∶1 000；Beclin1，1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜。第二天清洗PVDF膜后加入对应二抗室温封闭1 h，滴加ECL显色液进行曝光显影。用Image J对蛋白质条带灰度值进行定量分析。

表1 Sch B对MI/R小鼠心肌功能的影响

与Sham组比较：**P<0.01；与MI/R组比较：#P<0.05，##P<0.01

2 结果

2.1SchB对MI/R小鼠心肌功能的影响与Sham组比较，Sham+Sch B组小鼠血清LDH和CK含量无明显变化，表明Sch B对小鼠心脏功能无明显毒副作用 (P>0.05)；MI/R model组小鼠血清LDH和CK含量明显增多 (P<0.001)；与MI/R model组比较，MI/R model+Sch B组小鼠血清LDH和CK含量则明显降低，差异有统计学意义 (P<0.01)。同时，缺血再灌注能显著增加MI/R model组小鼠心肌梗死面积，降低小鼠心率 (Heart rate, HR) (P<0.01，表1)；MI/R model+Sch B组小鼠心肌梗死面积 (Infracion area，IA) 与MI/R model组小鼠比较明显减少，心率明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2SchB对MI/R小鼠心肌病理改变的影响HE染色结果显示，与Sham组比较，Sham+Sch B组小鼠心肌组织无明显改变；MI/R model组小鼠心肌组织心肌纤维排列紊乱，核固缩，心肌组织出现水肿，心肌间隙扩大。MI/R model+Sch B组小鼠心肌组织心肌纤维排列紊乱程度及间质水肿程度较MI/R model组比较均有所改善，见图1。

2.3SchB对MI/R小鼠线粒体自噬的影响与Sham组比较，MI/R model小鼠心肌组织COX Ⅰ和COX Ⅳ mRNA表达水平明显降低(P<0.05)；MI/R model+Sch B组小鼠心肌组织COX Ⅰ和COX Ⅳ mRNA表达水平较MI/R model组比较明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。同时，与Sham组比较， MI/R model组小鼠心肌组织自噬标记蛋白HIF-1α和Beclin1表达水平明显降低(P<0.05)。见图2。MI/R model+Sch B组小鼠心肌组织HIF-1α和Beclin1表达量明显高于MI/R model组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图1 Sch B对MI/R小鼠心肌病理改变的影响 ×200

表2 Sch B对MI/R小鼠线粒体功能的影响

与Sham组比较：*P<0.05；与Sham组比较：#P<0.05；与MI/R model组比较：#P<0.05

2.4SchB对腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphateactivatedproteinkinase,AMPK)/雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)/ULK1信号通路的影响实验结果表明，MI/R model组小鼠心肌组织p-AMPK和p-ULK1的蛋白表达水平较Sham组比较显著降低 (P<0.05)，p-mTOR表达水平明显升高 (P<0.05)；与MI/R model组比较，MI/R model+Sch B组小鼠心肌组织p-AMPK和p-ULK1的蛋白表达水平明显升高 (P<0.05)，p-mTOR表达水平明显降低 (P<0.05)，表明Sch B可诱导AMPK/mTOR/ULK1信号通路激活。见图3。

图2 Sch B对MI/R小鼠线粒体自噬的影响

图3 Sch B对AMPK/mTOR/ULK1信号通路的影响

2.5敲除AMPK对心肌损伤的影响敲除AMPK-β1能显著增加小鼠心肌梗死面积，降低小鼠心率，并抑制线粒体自噬相关蛋白HIF-1α和Beclin1表达 (P<0.05)。见表3、图4；缺血再灌注可进一步增加AMPK-β1-/-小鼠的心肌梗死面积，降低小鼠心率及HIF-1α和Beclin1的表达，与AMPK-β1-/- Sham组比较差异有统计学意义 (P<0.05，P<0.05)。见表3、图4，表明AMPK/mTOR/ ULK1信号通路参与了MI/R损伤的调控；Sch B能显著缩小MI/R损伤AMPK-β1-/-小鼠的心肌梗死面积，明显升高小鼠心率及HIF-1α和Beclin1蛋白表达水平，差异有统计学意义 (P<0.05)。见表3、图4。

表3 敲除AMPK对小鼠MI/R损伤的影响

与Sham组比较：*P<0.05；与Sham+Sch B组比较：#P<0.05，##P<0.01；与MI/R model组比较：$P<0.05

图4 敲除AMPK对线粒体自噬作用的影响

3 讨论

缺血性心血管病是最常见的心血管疾病[8]。缺血后血流再通的一段时间内，患者临床可发生血压骤降、心功能不全、心律减慢甚至猝死等一系列病情恶化的现象，是导致缺血性心血管病人死亡的主要原因[9]。虽然MI/R损伤的机制已经明确，但目前仍然只有较少的药物能影响MI/R预后[10]。因此，寻找新的药物及治疗方案减轻MI/R损伤是降低缺血性心血管病死亡率的关键。

本研究显示Sch B能显著降低MI/R模型小鼠血清LDH和CK的含量，缩小MI/R小鼠的心肌梗死面积，表明其具有明显的心脏保护作用，可对抗MI/R损伤。同时，HE染色实验表明Sch B还能明显改善MI/R损伤引起的心肌组织病理改变，表明Sch B可缓解MI/R诱导的心肌损伤。已有研究[11]表明，Sch B能够减轻MI/R损伤，具有较强的心肌保护作用。Zhang et al[10]研究显示，Sch B可通过调控内质网应激抑制MI/R模型大鼠心肌细胞凋亡。Sch B还可通过增强心肌谷胱甘肽抗氧化作用减轻MI/R损伤[7]。本研究结果与之前研究一致，进一步证明Sch B具有明确的心肌保护作用。此外，本文对Sch B抗MI/R损伤的作用机制进行了探讨。

本研究显示，缺血缺氧环境可明显降低线粒体标记蛋白COX I和COX IV的mRNA水平，表明缺血缺氧能下调线粒体功能。Sch B能显著升高MI/R小鼠心肌组织COX I和COX IV的mRNA水平，同时还能诱导缺血缺氧后心肌组织HIF-1α和Beclin1的表达。研究[12]表明，缺氧环境可导致线粒体功能障碍，从而导致三磷酸腺苷产生不足及活性氧(ROS)过度产生，过多的ROS可诱导心肌细胞凋亡并进一步加重线粒体损伤。COX I和COX IV是线粒体呼吸过程中的重要限速酶，参与了线粒体损伤导致细胞凋亡的过程[13]。线粒体自噬是监测线粒体功能、清除受损线粒体的重要机制[14]。研究[15]显示，线粒体自噬在MI/R损伤过程中具有心肌保护作用，其可能是通过清除受损线粒体调控线粒体功能、减少ROS产生，从而抑制心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用。已有研究[6]表明，缺氧环境可通过诱导线粒体自噬调控线粒体功能抑制心肌细胞凋亡。结合本实验结果表明，Sch B可能通过诱导心肌组织线粒体自噬减轻MI/R损伤。

研究[16]表明，AMPK/mTOR/ULK1可调控心肌细胞自噬抑制缺氧损伤诱导的心肌细胞凋亡。Sch B能促进MI/R小鼠心肌组织p-AMPK和p-ULK1的表达，抑制p-mTOR的表达，表明Sch B可促进AMPK/mTOR/ULK1信号通路激活。此外，敲除AMPK基因MI/R小鼠脑梗死面积明显增多，心率明显降低，表明激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路有利于减轻MI/R损伤。同时AMPK基因敲除小鼠经心肌缺血再灌注损伤处理后心肌组织HIF-1α和Beclin1表达水平较野生型小鼠明显减少，提示AMPK/mTOR/ULK1信号通路参与了MI/R损伤后线粒体自噬的调控。