长链非编码RNA在脊髓损伤中的研究进展

李子煜，程 里，祁 雷，余水生，姚 飞，张理乾，查小伟 综述 荆珏华 审校

脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是一种常见的中枢神经系统创伤，可造成患者严重且持续的运动和感觉功能障碍，给个人、家庭乃至整个国家带来沉重的经济和社会负担[1]。SCI的病理进程可以分为两个阶段：原发性损伤(第一阶段)和继发性损伤(第二阶段)。原发性损伤主要由压迫、挫伤或膨胀等导致的即刻机械性损伤，这一阶段常无法避免或干预。继发性损伤主要包括神经细胞凋亡、轴突脱髓鞘和切断、小胶质细胞活化和胶质瘢痕形成等，这一阶段持续时间可达数周甚至几个月且影响较重，但可以进行干预[2]。因此，利用治疗措施中断或抑制继发性损伤阶段有望促进SCI后功能恢复。SCI的治疗已经成为神经再生领域的研究热点，但目前临床SCI的治疗效果并不理想，因此不断探索并总结新的SCI治疗方式具有重要的科学和社会意义。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是由长度大于200个核苷酸组成的非编码RNA，这类RNA并无编码蛋白质功能，但可以在生物体内多种组织广泛表达，且具有构成染色质及基因表达调控等功能，从而参与到多种生理以及病理进程[3-4]。相关研究表明lncRNA参与到生理病理进程中从而发挥功能的机制主要包括：① lncRNA与染色质复合物相作用[5]；② lncRNA作为蛋白质和酶的调节因子[3, 6]；③ lncRNA与DNA/RNA结合蛋白相作用[7]；④ lncRNA与DNA直接相作用[8]。且相关研究表明lncRNA在SCI前后表达水平具有明显差异，且在SCI修复过程中起着重要作用[9-10]。因此，深入探讨并总结lncRNA参与SCI的功能和机制，将提高对SCI发病机制的认识，为SCI的治疗策略提供新的思路。本文将与SCI修复相关的lncRNA研究进展进行综述。

1 lncRNA在SCI后的表达与功能

在SCI前后lncRNA表达具有明显差异。2016年丁亚 等[9]利用基因芯片技术检测小鼠SCI后第1、3、7和21天(相当于SCI第二阶段)lncRNA差异性表达谱。结果表明在SCI后第1天lncRNA未见明显差异性表达；在第3天时，可以发现大量lncRNA出现差异性表达，其中212个lncRNA表达上调，290个lncRNA表达下调；在第7天时，差异性表达lncRNA数量较第3天明显增加，其中326个lncRNA表达上调，565个lncRNA表达下调；在第21天时，差异性表达lncRNA数量较第3天和第7天明显减少，其中141个lncRNA表达上调，40个lncRNA表达下调。根据京都基因与基因组百科全书(the database Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)对差异性lncRNA进行分析，发现这些差异性lncRNA可能通过神经配体受体信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路、黏附斑激酶信号通路、生化代谢信号通路、破骨细胞分化因子信号通路及溶酶体信号通路等生物学通路参与到SCI后神经系统功能紊乱及神经细胞生长、凋亡等进程。此外，2017年Duran et al[11]利用RNA测序技术检测大鼠SCI后1、2和3月时lncRNA表达情况，发现277个lncRNA出现差异性表达。经进一步分析发现这些差异性表达lncRNA可能与SCI进程中信号级联、表观遗传修饰和免疫反应等功能有关。继上述研究之后，2018年Zhou et al[10]利用基因芯片技术检测SD大鼠SCI后2 h(相当于SCI第一阶段)lncRNA差异性表达谱，P<0.05以及表达水平改变2倍以上被认为具有差异性表达。结果表明SCI后772个lncRNA差异性表达，其中528个lncRNA(68.39%)表达上调，244个lncRNA(31.61%)表达下调。此外，lncRNA表达上调最高者达124倍，lncRNA表达下调最低者达15倍。经进一步分析发现这些差异性表达lncRNA可能通过Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)信号通路、p53信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路和Janus激酶-信号转导子和转录激活子(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，Jak-STAT)信号通路参与到SCI后损伤免疫应答、小胶质细胞神经保护反应、神经细胞凋亡及创伤相关炎症反应等进程。

综合以上研究表明：在SCI后lncRNA差异性表达明显，且具有时间差异性。这些差异性表达lncRNA在SCI病程发挥着重要作用。

2 lncRNA-SCIR1、lncRNA-XIST和lncRNA-Map2k4在SCI中的作用

2.1lncRNA-SCIR1在SCI中的作用SCI后，星形胶质细胞、成纤维细胞和巨噬细胞在损伤位点共同形成致密的瘢痕，从而阻止进一步损伤[12]。然而，这种瘢痕自身的物理性屏障作用以及分泌抑制性因子将会阻止神经纤维的再生[13]。Wang et al[14]利用转录组测序技术检测大鼠SCI后第1、4和7天时lncRNA及mRNA表达情况，筛选出一种在SCI后不同时间点表达水平均明显降低的lncRNA(RGD1559747，编码基因位于4号染色体锌指蛋白(Zfp775)侧面)并命名为lncRNA-SCIR1。此外，在体外培养的星形胶质细胞中使lncRNA-SCIR1表达沉默之后，发现星形胶质细胞明显增殖数量达2倍以上，且迁移能力明显增强。这初步表明lncRNA-SCIR1的下调可以通过促进星形胶质细胞增殖和迁移进而促进SCI后损伤位点瘢痕的形成。为进一步探讨lncRNA-SCIR1的可能作用机制，研究者筛选出与lncRNA-SCIR1相关性最高的，且已被证实参与到SCI进程中的4个mRNA，其中肾上腺髓质素(adrenomedullin，Adm)mRNA和骨形态生成蛋白(bone morphogenetic protein 7，Bmp7)mRNA在SCI后表达水平明显升高，而无翅型MMTV整合位点家族成员3(wingless-type MMTV integration site family member 3，Wnt3)mRNA和α-突触核蛋白(alpha-synuclein，SNCA)mRNA在SCI表达水平明显降低。相关研究[15-16]已经证实Wnt3的上调以及Bmp7的下调可以促进髓鞘再生并且缓解神经胶质抑制，从而促进SCI后功能恢复。当在体外培养的星形胶质细胞中沉默lncRNA-SCIR1表达后，发现Bmp7表达明显升高，而Wnt3表达明显降低。进一步说明lncRNA-SCIR1可能通过下调Bmp7以及上调Wnt3从而促进SCI后神经功能恢复。

2.2lncRNA-XIST在SCI中的作用Gu et al[17]利用基因芯片技术检测大鼠SCI前后lncRNA表达情况，结合GEO(Gene Expression Omnibus)数据库筛选出一种表达差异性显著的lncRNA-XIST，该lncRNA在SCI后的第1、3、7天表达均明显增加。相关研究[18]表明lncRNA-XIST在肿瘤细胞凋亡方面具有重要作用。当SCI大鼠lncRNA-XIST表达被沉默之后，发现SCI位点凋亡细胞数量明显减少，且大鼠运动功能BBB(Basso-Beattie-Bresnahan)评分明显提高，初步表明lncRNA-XIST的下调对SCI后大鼠具有保护作用，可以促进其功能恢复；此外，相关研究[19]表明lncRNA-XIST在乳癌中可以抑制PI3K/AKT信号通路，且PI3K/AKT信号通路在SCI后的细胞凋亡进程中起着重要作用[20]。当抑制SCI后大鼠体内lncRNA-XIST表达时，AKT及其下游哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)磷酸化水平明显升高。进一步表明SCI后，抑制lncRNA表达可以激活PI3K/AKT信号通路；大量研究[4]表明lncRNA可以作为竞争性内源RNA(competing endogenous，ceRNA)竞争性抑制相应miRNA(microRNA)的表达从而发挥基因表达调控的作用。研究者利用生物信息学软件筛选出一种受到lncRNA-XIST调控并与细胞凋亡有关的miRNA-494，经研究发现在SCI后lncRNA-XIST可以下调miRNA-494的表达。此外，相关研究[21]表明同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog，PTEN)作为PI3K/AKT信号通路负性调控蛋白，可以抑制SCI后神经再生及功能恢复。经进一步实验研究发现，SCI后miRNA-494的过表达可以通过抑制PTEN表达，进而激活PI3K/AKT信号通路，最终抑制神经细胞凋亡且促进大鼠运动功能恢复。综合lncRNA-XIST对miRNA-494表达的抑制作用且经过体内实验验证发现：下调lncRNA-XIST可以上调miRNA-494表达，从而抑制PTEN的表达进而激活PI3K/AKT信号通路，最终抑制神经细胞凋亡并促进大鼠运动功能恢复，起到治疗SCI的作用。

2.3lncRNA-Map2k4在SCI中的作用Ding et al[22]利用基因芯片技术检测小鼠SCI前后lncRNA差异性表达情况，发现一种lncRNA(ENSMUST 00000138093)在SCI后表达水平明显下降，且其表达水平与成纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor 1，FGF1)mRNA表达水平呈动态相关。已有研究[23]表明FGF1是一种神经营养因子，在胶质细胞中有高水平的表达，且具有神经保护和神经再生功能。继Ding et al[22]研究之后，Lv et al[24]将lncRNA(ENSMUST00000138093)命名为lncRNA-Map2k4，并利用生物信息学软件筛选出与其相关性较高的miRNA-199a，经实验研究表明在脊髓神经元细胞中lncRNA-Map2k4可以作为ceRNA抑制miRNA-199a的表达；经进一步研究表明在脊髓神经元细胞中，miRNA-199a的上调可以抑制FGF1的表达。结合lncRNA-Map2k4对miRNA-199a的调控作用，经一系列验证实验表明下调lncRNA-Map2k4可以通过上调miRNA-199a进而抑制FGF1的表达；进一步研究发现lncRNA-Map2k4和FGF1两者均可以促进脊髓神经元细胞的增殖及抑制凋亡，而miRNA-199a可以抑制神经元细胞增殖并促进凋亡。因此，lncRNA-Map2k4可以通过竞争性抑制miRNA-199a表达从而促进FGF1的表达，最终促进脊髓神经元细胞的增殖及抑制凋亡，起到治疗SCI的作用。

2.4其他lncRNA在SCI中的作用神经干细胞(neural stem cells，NSCs)可以增殖分化为星形胶质细胞、神经元细胞和少突胶质细胞，且大量研究[25]表明调控NSCs增殖及分化可以作为SCI的潜在治疗手段。Zheng et al[26]研究发现lncRNA-UCA1在NSCs中的表达呈时间依赖性上调，当敲除该lncRNA基因后NSCs增殖受到抑制。经过进一步研究发现，敲除lncRNA-UCA1基因可以促进miRNA-1表达进而抑制转录因子Hes1的表达，从而抑制神经球的形成，同时抑制NSCs向星形胶质细胞增殖分化并促进NSCs向神经元分化。因此，lncRNA-UCA1对NSCs增殖及分化的调控作用有望作为SCI后神经修复的潜在治疗手段。

氢化硫被公认为中枢神经系统中一种重要的神经调节剂和神经保护剂，并且硫化氢对SCI后的脊髓缺血再灌注损伤具有保护作用[27]。Liu et al[28]研究发现大鼠脊髓缺血再灌注损伤后，硫化氢的干预可以促进lncRNA-CasC7的表达并降低miRNA-30c的表达，同时硫化氢可以抑制缺血再灌注损伤导致的神经细胞凋亡。经进一步研究发现：硫化氢可以上调lncRNA-CasC7的表达从而竞争性抑制miRNA-30c的表达，进而抑制神经细胞凋亡，最终对脊髓缺血再灌注损伤大鼠模型起到保护作用。因此，lncRNA-CasC7可以作为SCI治疗的潜在靶点。

小胶质细胞(microglial cells，MGs)作为中枢神经系统中的一种吞噬细胞，在神经细胞的营养、保护和修复中发挥着重要的作用[29]。Zhou et al[30]研究发现，SCI后大鼠脊髓中lncRNA-MALAT1表达水平明显升高，并伴有IKKβ/NF-κB(inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase/ nuclear factor kappa-B)信号通路的激活以及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)和白介素-1β(interleukin 1 beta,IL-1β)水平升高。经进一步研究发现MGs中lncRNA-MALAT1可以通过竞争性抑制miRNA-199b的表达从而激活IKKβ/NF-κB信号通路并促进TNF-α和IL-1β的表达。此外，敲除lncRNA-MALAT1基因可以促进SCI后大鼠运动功能恢复。因此，敲除lncRNA-MALAT1可以通过调控miRNA-199b/IKKβ/NF-κB信号通路从而抑制SCI后MGs炎症反应，起到治疗SCI的作用。

3 展望

目前治疗SCI的研究主要是针对继发性损伤阶段，其病理过程主要包括神经细胞凋亡、轴突脱髓鞘和切断、小胶质细胞活化和胶质瘢痕形成等。但由于SCI继发性损伤的病理进程非常复杂且具体机制仍未明确，导致临床上仍未有理想的治疗措施。因此，探索新的SCI治疗手段并研究其机制具有重要的科学和社会价值。近年来，大量研究表明lncRNA可以通过调控基因表达等作用在多种疾病进程中发挥着重要作用。本文中讨论的各种研究表明lncRNA在SCI的病理进程中同样发挥着重要作用，并且调控相应lncRNA表达水平可以抑制继发性损伤并促进SCI后功能恢复，这对于设计新的分子治疗方案具有重要意义(图1)。因此，未来更多基于lncRNA与SCI的研究有望为SCI的临床治疗提供新的方案。

图1 长链非编码RNA在脊髓损伤中的作用简图