微生态制剂与酶制剂联合使用对断奶仔猪生长性能、血液指标和肠黏膜防御屏障相关蛋白表达的影响

■余 婕程 蕾 陶弼菲 周 樱胡修忠向 敏夏 瑜王定发*

（1.武汉市农业科学院畜牧兽医研究所，湖北武汉430208；2.武汉新华扬生物股份有限公司，湖北武汉430000）

断奶是养猪生产中的关键环节之一。对仔猪实施早期断奶措施不仅能够提高母猪年生产力和分娩舍的利用率，也能够降低仔猪的生产成本[1]。然而，由于在此过程中，仔猪经受了环境、日粮、心理等方面的应激，极易导致其采食量下降、增重缓慢和腹泻等断奶应激综合征现象[2]。抗生素作为一种抗病、促生长的饲料添加剂被广泛添加于仔猪日粮中，但是由于抗生素的大量和长期使用，由此而产生的药物残留以及细菌耐药性问题日益突出，寻找抗生素替代品成为了必然选择。微生态制剂是一类用于调节宿主肠道微生态平衡，提高宿主健康水平的活菌制剂及其代谢产物。有研究指出，微生态制剂能够增强机体免疫力，提高饲料转化率，改善动物肠道菌群结构和生产性能，具有安全、无残留、无耐药性和无毒副作用等优点，是理想的抗生素替代品之一[3-4]。饲用酶制剂同样也作为一种饲料添加剂被广泛应用于动物日粮中，主要包括植酸酶、蛋白酶、脂肪酶、非淀粉多糖酶等，可用于提高饲料利用率，改善动物生产性能，并可节约饲料资源，也可减少畜禽排泄物中氮、磷等物质的含量，有助于减轻环境污染问题[5]。早期断奶阶段的仔猪胃肠道发育不完全，消化酶分泌量不足，日粮的突然改变容易引起肠道损伤，因此需要外源性添加酶制剂以补充自身消化酶分泌量的不足[6-7]。近年来关于微生态制剂与酶制剂单独添加于畜禽日粮中的研究较多，但对于其联合使用的研究报道相对较少。本试验通过向断奶仔猪日粮中同时添加酶制剂和多种益生菌，研究对其生产性能、血液指标和肠道防御屏障功能的影响，为复合微生态制在仔猪生产中的推广应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

由酶制剂和多种益生菌组成的复合微生态制剂由武汉新华扬生物技术有限公司提供，含木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、淀粉酶、蛋白酶、屎肠球菌、丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。

1.2 试验设计及饲养管理

采用单因子试验设计，选取体重相近[（7.39±0.12）kg]、健康状况良好的“长×大”24日龄断奶仔猪180头，随机分为2组（每组3个重复，每个重复30头猪）。对照组饲喂基础日粮，试验组在基础日粮中添加100 g/t的酶制剂+微生态制剂。试验基础日粮组成及营养水平见表1。本试验在武汉市金龙畜禽有限公司仙人桥猪场进行，试验期25 d，整个试验期间采用自由采食和饮水，保持猪舍的清洁，并及时消毒。

1.3 样品采集与处理

在试验第26 d早上7：00对仔猪空腹称重后，每个重复随机选择3头猪前腔静脉采血，并分离血清，置于-20℃保存待测。每个重复随机选择1头猪进行屠宰，分离肠道，于空肠1/2处取10 cm左右肠段，用预冷的生理盐水将肠道内容物冲洗干净，纵向剪开肠段，迅速用吸水纸吸干表面水分以及其他杂质，用载玻片沿同一方向轻轻刮取空肠黏膜置于冻存管中，将冻存管迅速置于液氮中速冻，保存于-80℃冰箱待测。

1.4 测定指标

1.4.1 生长性能

分别于试验第1、26 d时以重复为单位对试验猪进行空腹称重，并在试验期间记录饲料消耗量，计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI），以及料重比（F/G）。

表1 基础日粮组成及营养水平

1.4.2 血清生化指标

采用南京建成生物工程研究所生化试剂盒测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）的含量、总超氧化物歧化酶（T-SOD）活力以及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力，测定方法按说明书进行。

1.4.3 血清免疫球蛋白及细胞因子含量

采用南京建成生物工程研究所ELISA试剂盒测定血清中免疫球蛋白（IgG）、白介素2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）含量，具体操作参见说明书。

1.4.4 空肠黏膜分泌型免疫球蛋白含量

称取适量空肠黏膜冻存样品，与预冷的生理盐水按1∶9（w/v）进行研磨匀浆，然后将研磨液3 000 r/min离心10 min，取上清液，放4℃冰箱待测。用南京建成生物工程研究所的ELISA试剂盒测定分泌型免疫球蛋白（Secretory Immunoglobulin A,sIgA）含量，具体步骤参见说明书。

1.5 组织中总蛋白的提取

取少量的组织置于2 ml EP管中，加入清洗干净的钢珠，每管加入300 μl组织裂解液（含PMSF），置于自动匀浆机中匀浆。匀浆完成后将EP管置于冰上充分裂解30 min。裂解完成后，用移液器将裂解液转移至1.5 ml离心管中，然后4℃ 12 000 r/min离心5 min，吸取上清，BCA法测定蛋白浓度后分装于1.5 ml离心管中，置于-80℃冰箱待测。

1.6 Western Blot

制备浓缩胶和分离胶，加样后100 V电泳分离，然后电转移到PVDF膜上，封闭后加入兔多抗闭锁小带蛋白1（Zonula occludens protein 1，ZO-1）和闭合蛋白（Occludin）的一抗（购自武汉三鹰生物技术有限公司），4℃过夜，二抗室温孵育1 h，底物显色用Thermo ECL试剂盒，具体操作按照说明书进行。

1.7 统计分析

试验数据采用GraphPad Prism 5.0软件进行分析，以P＜0.05作为差异显著性判断标准，结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 微生态制剂与酶制剂联合使用对断奶仔猪生长性能的影响（见表2）

由表2可见，与对照组相比，断奶仔猪日粮中添加酶制剂和微生态制剂有提高其平均日增重和平均日采食量，降低料重比的趋势（P＞0.05）。

2.2 微生态制剂与酶制剂联合使用对断奶仔猪血清生化指标的影响（见表3）

由表3可见，与对照组相比，日粮中添加酶制剂和微生态制剂显著降低了断奶仔猪血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性（P＜0.05）；对碱性磷酸酶、总超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活力，以及丙二醛含量均无显著影响（P＞0.05）。

表3 微生态制剂与酶制剂联合使用对断奶仔猪血清生化指标的影响

2.3 微生态制剂与酶制剂联合使用对断奶仔猪血清免疫球蛋白及细胞因子含量的影响（见表4）

由表4可见，与对照组相比，日粮中添加酶制剂和微生态制剂对断奶仔猪血清IgG含量无显著影响(P＞0.05)，显著提高了IL-2和TNF-α的含量(P＜0.05)。

2.4 微生态制剂与酶制剂联合使用对断奶仔猪肠黏膜分泌型免疫球蛋白A含量的影响(见图1)

由图1可见，与对照组相比，日粮中添加酶制剂和微生态制剂显著提高了断奶仔猪空肠黏膜中sIgA的含量（P＜0.05）。

表4 微生态制剂与酶制剂联合使用对断奶仔猪血清免疫球蛋白及细胞因子含量的影响

图1 微生态制剂与酶制剂联合使用对断奶仔猪空肠黏膜sIgA含量的影响

2.5 微生态制剂与酶制剂联合使用对断奶仔猪肠道紧密连接蛋白表达的影响（见图2）

由图2可见，与对照组相比，日粮中添加酶制剂和微生态制剂显著提高了断奶仔猪空肠黏膜中紧密连接蛋白 ZO-1（P＜0.05）和 Occludin（P＜0.01）的表达量。

3 讨论

仔猪断奶后产生的应激往往导致生产性能的降低和消化系统功能紊乱[8]。本试验所用复合微生态制剂由酶制剂和多种益生菌组成，可为仔猪提供有机酸、消化酶类等对肠道健康有益的物质。本试验结果显示，通过向断奶仔猪饲粮中添加酶制剂和微生态制剂，其平均日增重提高了2.65%，料重比降低了1.85%（P＞0.05）。这与梁恒之等[9]的研究结果类似，该研究小组向仔猪饲粮中添加250 g/t的合生元，主要成分为低聚木糖、低聚壳聚糖、枯草芽孢杆菌、丁酸梭菌等，结果发现对其平均日增重和料重比均无显著影响。然而，也有一些研究报道与本试验结果不尽相同。李瑞等[10]通过向生长猪日粮中添加2 000 g/t的微生态制剂，主要成分为主要含乳酸杆菌、芽孢杆菌和酵母菌，结果发现显著提高了平均日增重，但对料肉比无显著影响。李雪莉等[11]向断奶仔猪日粮中添加200 g/t以植物乳杆菌为主的复合微生态制剂，结果表明可显著提高其平均日增重和采食量，并显著降低料重比。导致试验结果不尽相同的原因可能是复合微生态制剂的组成或在日粮中的添加剂量不同，本试验中复合微生态制剂的添加量相对较低。

图2 微生态制剂与酶制剂联合使用对断奶仔猪空肠紧密连接蛋白表达的影响

对血清生化指标的测定可在一定程度上反映机体的健康状态。ALT和AST主要存在于肝脏和心脏的组织细胞中，正常情况下在血清中活性较低，当机体出现应激情况时，血清中的转氨酶活性升高。ALP是与机体消化代谢相关的酶，其活性高低可反映动物的生长状况[12]。本试验结果显示，断奶仔猪日粮中添加酶制剂和微生态制剂显著降低了血清中ALT和AST活性，对ALP活性无显著影响，表明添加该复合微生态制剂具有一定改善肝脏功能的作用，有利于肝脏的健康发育。杨红萍等[13]向断奶仔猪日粮中添加2 000 g/t由乳酸菌、芽孢杆菌、双歧杆菌按2∶1∶1组成的复合微生态制剂，结果发现可降低AST和ALP活性，与本试验结果类似。GSH-Px和SOD是生物体内广泛存在的重要抗氧化酶，MDA的含量则是反映生物膜脂质过氧化水平和对生物膜损伤程度的指标，因此测定T-SOD和GSH-Px活力以及MDA的含量可以反映机体清除氧自由基的能力和脂质过氧化损伤的程度。本试验结果显示，添加100 g/t的酶制剂和微生态制剂对断奶仔猪血清T-SOD和GSH-Px活力以及MDA的含量无显著影响。梁恒之等[9]向仔猪饲粮中添加250 g/t的合生元，结果发现对其血清T-SOD活力和T-AOC无显著影响，与本试验结果有一定相似之处。

体液免疫是机体防御疾病的重要途径，免疫球蛋白IgG是血清中主要的抗体成分，检测其含量可反映机体体液免疫功能。细胞因子具有调控机体免疫应答、及损伤组织修复等多种功能。本试验结果显示，添加100 g/t的酶制剂和微生态制剂对断奶仔猪血清IgG含量无显著响，但显著提高了IL-2和TNF-α的含量。张建梅等[14]向断奶仔猪日粮中添加2‰的复合微生态制剂，发现对血清IgG含量无显著响。李瑞等[10]也发现有类似的试验结果。

sIgA在肠黏膜免疫中发挥重要作用，可抑制病原微生物在肠黏膜上的附植，是机体肠道黏膜免疫的第一道屏障[15]。研究表明，益生菌可通过刺激sIgA的产生增强黏膜屏障功能[16]。本试验结果显示，向断奶仔猪饲粮中添加100 g/t的酶制剂和微生态制剂可显著提高空肠黏膜中sIgA的含量。秦红等[17]向育肥猪日粮中添加100 g/t的芽孢杆菌制剂，发现显著提高了空肠和回肠中sIgA的含量。肖宏德[18]向断奶仔猪日粮中添加100 g/t枯草芽孢杆菌和300 g/t屎肠球菌，发现可显著提高十二指肠中sIgA含量。上述研究报道均与本试验结果类似，表明本试验所用复合微生态制剂具有一定增强肠黏膜免疫功能的作用。

肠道紧密连接是肠黏膜上皮细胞间的一种重要的连接方式，构成了肠道重要的机械屏障，对于抵御病原微生物通过肠黏膜进入机体内部组织具有重要作用，Occludin和ZO-1均是重要的紧密连接蛋白[19]。本试验结果显示，向断奶仔猪饲粮中添加酶制剂和微生态制剂可显著提高空肠黏膜中ZO-1和Occludin蛋白的表达量。李雪莉等[20]研究发现，向断奶仔猪日粮中添加植物乳杆菌可显著上调空肠和回肠中Occludin和ZO-1 mRNA水平。庞敏等[21]向断奶仔猪日粮中添加500 g/t的酪酸梭菌发现可显著上调回肠和结肠中Occludin mRNA表达量，但对ZO-1 mRNA水平无显著影响。上述研究报道与本试验结果基本类似，本试验将酶制剂与微生态制剂联合使用添加于断奶仔猪日粮中，其中的益生菌可能通过产生的代谢产物影响肠道黏膜紧密连接蛋白表达。

4 结论

在断奶仔猪日粮中添加微生态制剂和酶制剂，有提高平均日增重，降低料重比的趋势；可显著降低血液中ALT和AST活性，具有促进肝脏健康的作用；对机体的抗氧化能力无显著影响；显著提高了空肠黏膜sIgA和紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达量，提示具有一定增强肠黏膜防御屏障功能的作用。