夏枯草口服液对STAT3和NF-KB信号转导通路的影响

李定祥 牛明辉 张杰⋆

夏枯草口服液由单味中药夏枯草制备而成。《中国药典》［1］指出夏枯草有清火、明目、散结、消肿的功效，具有降压、降糖、抗菌、抗炎、抗过敏及抗病毒等药理作用。临床研究表明，夏枯草可显著降低IL-1β、TNF-α等促炎性细胞因子水平［2-3］，对亚急性甲状腺炎［4-5］、慢性乳腺炎［6］等炎性疾病也有显著疗效。JAK-STAT3信号通路是介导炎症相关细胞因子信号传导的重要通路，与体内炎症反应具有非常密切的关系［7］。核因子KB（NF-KB）是一组调节广泛基因表达的核蛋白因子，在参与炎症反应，细胞增殖、分化与凋亡，免疫反应和肿瘤形成等相关的基因转录调控中有重要作用［8-9］。本文研究夏枯草口服液对STAT3及NFKB信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器 超净台（上海上净净化设备有限公司），电子天平（METTLER TOLEDO AL104型），Eppendorf 5810R离心机，徕卡Leica DMI3000 B倒置显微镜，Thermo CO2培养箱，TECAN F200酶标仪。

1.2 药物与试剂 α-MEM培养基（Gibco公司），DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（Gibco公司，批号10099-141），胰酶（Amresco公司），双抗（Amresco公司），荧光素酶检测试剂盒（Promega公司），IL-6（ProTech公司），TNF-α（Sigma公司）。4#细胞（稳定转染了STAT1-luciferase和STAT3-luciferase报告基因质粒的HepG2细胞，培养条件为α-MEM+10%FBS），14#细胞（稳定转染了NF-KB-luciferase报告基因质粒的293细胞，培养条件为DMEM+10%FBS）。夏枯草口服液（贵阳新天药业股份有限公司，批号：170821）。

1.3 样品制备 用直径为22μM的微孔滤膜正压过滤夏枯草口服液（总黄酮：11.7mg/ml；迷迭香酸：2.01mg/ml），经冷冻干燥成粉末，取夏枯草口服液冻干粉适量，以无菌超纯水配制成200mg/ml的溶液，再以无菌超纯水梯度稀释得 100mg/ml、50mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.2mg/ml、0.04mg/ml，置 -80℃冰箱过夜，备用。临用前，以培养基稀释10倍后用于筛选。

1.4 细胞培养及活性测定 人肿瘤细胞4#HepG2细胞和14#293细胞，细胞生长至对数生长期后，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清液，适量培养基悬浮，调整细胞浓度至3×105/ml。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔100μl，放置细胞培养箱（37℃，5%CO2）中培养48h后，吸去培养基，夏枯草组每孔加入100μl稀释好的药物，每药设2复孔。夏枯草口服液终浓度分别为 20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.02mg/ml和 0.004mg/ml。培养 1h 后每孔加入激动剂（IL-6/TNF-α，10ng/ml）11μl。设阴性对照组，不加激动剂和夏枯草溶液，设模型组，加入激动剂，但不加夏枯草溶液。培养5.5h弃去培养基，每孔加入1×细胞裂解液30μl，震荡使细胞充分裂解。取20μl到酶标板中，加入30μl荧光素酶底物。酶标仪检测，计算抑制率［抑制率%=（模型组荧光强度-夏枯草组荧光强度）/模型组荧光强度×100%］。

1.5 统计学方法 应用Prism Graphpad统计软件计算IC50值。

2 结果

2.1 夏枯草口服液抑制STAT3信号通路 IL-6可激活STAT3信号通路，荧光强度OD值为620.0。夏枯草口服液0.5 mg/ml对STAT3信号通路抑制率为57.18%，1mg/ml时抑制率81.53%，20 mg/ml时抑制率为98.55%，表明夏枯草口服液对IL-6诱导的STAT3信号通路具有抑制作用，在一定浓度范围内呈浓度依赖性（见表1）。其抑制STAT3的IC50为0.4591mg/ml（见图1）。

表1 夏枯草口服液抑制STAT3信号转导通路的活力

图1 夏枯草口服液抑制STAT3信号转导通路IC50

2.2 夏枯草口服液抑制NF-KB信号通路 TNF-α可激活NF-KB信号通路，荧光强度OD值为12958.5。夏枯草口服液0.5mg/ml对STAT3信号通路抑制率为58.36%，1mg/ml时抑制率91.29%，20mg/ml时抑制率为99.94%，表明夏枯草口服液对TNF-α诱导的NF-KB信号通路具有抑制作用，且呈浓度依赖性（见表2），其抑制NF-KB的IC50为0.3719mg/ml（见图2）。

表2 夏枯草口服液抑制NF-KB信号转导通路的活力

图2 夏枯草口服液抑制NF-KB信号转导通路IC50

3 讨论

信号传导与转录激活因子（STAT）蛋白家族是一个由STAT 基因编码合成的蛋白质家族，可以被不同的细胞因子受体激活，在细胞因子-受体相互作用的过程中充当载体，保持信号在细胞内传递的内在特异性［10］。STAT的七个蛋白家族中，STAT3是一种广泛表达于人和鼠各组织细胞的转录调节因子。JAK/STAT3信号通路是STAT3活化的一条经典途径，较多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，包括白介素2～7、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、生长激素、表皮生长因子、血小板衍生因子及干扰素等。研究发现，STAT3信号通路参与较多生理病理过程，STAT3的异常活化可导致先天免疫、适应性免疫，急、慢性炎症，及肿瘤等疾病的发生［11］，是炎症形成过程中不可或缺的关键性因素［12-13］。

核因子KB（NF-KB）是从鼠B淋巴细胞核提取物中发现的一种核蛋白因子。在静息状态下，IκB-α与NF-KB p65、p50两个亚单位以失活状态存在于细胞质中。肿瘤坏死因子TNF作用于肿瘤坏死因子受体TNFR，激活IKK（IκB kinase），活化的IKK会泛素化、磷酸化并降解IκB-α，使NF-KB两个亚单位从失活状态活化，并从细胞质转移到细胞核内（尤其是p65亚单位），与相应的炎症相关基因结合，启动炎性细胞因子转录，诱发炎症［14］。

本资料结果显示，夏枯草口服液对IL-6诱导的STAT3信号通路和TNF-α诱导的NF-KB信号通路具有抑制作用，且呈浓度依赖性，揭示夏枯草口服液的体外抗炎作用机制，其对JAK-STAT、NF-KB信号通路的抑制作用需要进一步体内试验的验证，进一步明确其体内抗炎作用。同时还需要进一步探究其发挥抗炎作用机制的物质基础。夏枯草含有的化学成分种类较多，酚酸是广泛存在于夏枯草中的一类主要活性成分，文献报道夏枯草中酚酸主要有迷迭香酸、迷迭香酸丁酯、咖啡酸、丹参素、迷迭香酸甲酯、3，4-二羟基苯甲酸等［15］。前期研究中发现，迷迭香酸能明显抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀、醋酸所致小鼠毛细血管通透性增高及大鼠棉球肉芽肿性炎症。另外，迷迭香酸能降低炎症模型动物血清中炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、CRP的含量［16］。需要进一步验证迷迭香酸是否为夏枯草口服液抑制JAK-STAT、NF-KB信号通路的物质基础，为夏枯草口服液抗炎作用机制提供依据，为夏枯草的临床应用和进一步开发起指导作用。