EB病毒感染患儿免疫细胞功能变化及其临床意义

刘雪凯 王迎时 辛勤 高雨菡

[摘要] 目的 研究儿童EB病毒（EBV）感染引起外周血淋巴细胞亚群及T淋巴细胞功能的变化，并探讨血清EBV DNA载量与淋巴细胞亚群变化的关系。 方法 选取航天中心医院（以下简称“我院”）2015年1月～2018年7月收治的25例EBV感染患儿作为感染组;另选我院同期体检的25名健康者作为对照组。采用流式细胞术检测外周血中淋巴细胞亚群及CD8+ T淋巴细胞穿孔素和颗粒酶B的表达情况。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测外周血单个核细胞（PBMC）分泌γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）水平。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（FQ-PCR）技术检测血清EBV DNA载量。 结果 感染组外周血CD3+、CD8+细胞比值及绝对值明显高于对照组（P < 0.001），CD4+细胞比值显著低于对照组（P < 0.001），但两组细胞绝对值间差异无统计学意义（P > 0.05），而感染组CD4/CD8比值显著低于对照组（P < 0.001），但其比例变化与患儿血清EBV DNA载量不存在线性相关（r = 0.19，P > 0.05）。CD19+细胞比值及绝对值均低于对照组（P < 0.001）。两组CD16+CD56+NK细胞比值及绝对值差异无统计学意义（P > 0.05）。与对照组比较，感染组PBMC的IFN-γ分泌增多（P < 0.01），IL-4分泌减少（P < 0.05）;CD8+ T细胞穿孔素和颗粒酶B分泌显著增加（P < 0.05）。 结论 感染组外周血中淋巴细胞亚群及其功能有明显变化，检测其变化规律对了解患儿细胞免疫功能状况及指导临床治疗有重要意义。

[关键词] EB病毒;淋巴细胞亚群;γ干扰素;白细胞介素4;穿孔素

[中图分类号] R725.1;R440          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）03（b）-0072-05

EB病毒（EBV）为双链DNA病毒，其感染多发生于儿童时期，可累及全身多个器官，与多种疾病的发生有密切联系，如传染性单核细胞增多症、淋巴瘤等[1-3]。EBV主要侵犯B淋巴细胞，并且能在感染后引起强烈的细胞免疫反应，患者往往出现免疫细胞特别是淋巴细胞比例及多种细胞因子水平异常[4-6]。机体免疫水平及其对EBV的免疫应答状态与感染后不同临床表现及疾病预后有密切关系。既往研究多关注于淋巴细胞亚群的改变，其对淋巴细胞功能的研究并不深入。

本研究通过检测EBV感染儿童外周血淋巴细胞亚群及其功能变化以及其与EBV DNA载量的关系，以揭示EBV对儿童免疫功能的影响，深化对该病发病机制的认识，为临床检测及治疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取航天中心医院（以下简称“我院”）2015年1月～2018年7月收治的EBV感染儿童25例作为感染组。纳入标准：①符合《儿童EB病毒相关疾病的诊断标准和治疗原则》[7]的诊断标准;②EBV DNA>1×103拷贝/mL，患儿血清EBV衣壳抗原IgM检测呈阳性;③患儿家属自愿参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：①合并心肌炎、肝炎、溶血性贫血及血小板减少的危急病情;②入院前有相关免疫调节治疗。感染组男14例，女11例;年龄1～12岁，平均（4.5±0.6）岁。另取我院同期体检健康者25名为对照组，男15名，女10名;年龄1～12岁，平均（5.3±0.8）岁;体检者近期均无感染及传染病症状。两组年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准。

1.2 仪器与试剂

BriCyte E6流式细胞仪及原装配套抗体、溶血剂和质控物（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）;ABI 7500实时荧光定量PCR分析仪（Thermo Fisher），相关检测试剂（生产批号：p1101706004）购于天隆科技公司;抗体包括T淋巴细胞抗体试剂：CD3-FITC/CD8-PE/CD45-perCP/CD4-APC;B淋巴细胞抗体试剂：CD3-FITC/CD16+CD56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC（批號：2017040100）、γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4） ELISA试剂盒购（生产批号：20141026）购自美国R&D公司;Anti-human perforin（生产批号：563762）、Anti-human granzyme B（生产批号：560211）、Anti-human CD8（生产批号：561952）、IC Fixation Buffer、10×Permeabilization Buffer（生产批号：554715）购于美国BD公司。

1.3 淋巴细胞亚群检测

采用全血免洗法，即上机后流式细胞仪自动设门检测CD3+T细胞、CD4+T细胞（CD3+CD4+）、CD8+T细胞（CD3+CD8+）、B淋巴细胞（CD19+）和自然杀伤（NK）细胞（CD3-CD16+56+）占淋巴细胞总数的百分比及其绝对值，绝对值测量方法为体积法。CD3+/CD4+比值为计算值。

1.4 IFN-γ、IL-4检测

采用密度梯度离心法分离单个核细胞（PBMC），调整细胞浓度为1×106/mL，加入24孔板中，ConA（50 μg/mL）刺激48 h后收集上清，按照各自说明书检测。

1.5 穿孔素及颗粒酶B的检测

受试者外周肝素抗凝静脉血裂解红细胞后，加入Anti-human CD8避光染色30 min，洗涤离心，细胞加入固定剂和通透剂，洗涤离心，加入Anti-human perforin、Anti-human granzyme B避光染色30 min后上机检测。

1.6 EBV DNA定量检测

采用实时荧光定量PCR技术检测EBV DNA的载量。EDTA抗凝全血3 mL，3000 r/min离心10 min，取50 μL血浆，加入50 μL核酸提取液，振荡混匀15 s，干浴10 min后，以12.5 cm的离心半径1500 r/min离心10 min，取上清液供实时荧光定量PCR使用。

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0統计学软件对数据进行分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，相关性分析采用Spearman相关分析。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血淋巴细胞亚群比值比较

感染组CD3+、CD8+细胞比例（CD3+：86.05±1.17;CD8+：65.52±1.88）明显高于对照组（CD3+：68.08±1.85;CD8+：19.39±1.66），差异有高度统计学意义（P < 0.001），且其CD4+、CD4/CD8比值（CD4+：14.35±0.96;CD4/CD8：0.23±0.02）显著低于对照组（CD4+：43.35±1.28;CD4/CD8：2.43±0.23），差异有高度统计学意义（P < 0.001）。感染组CD19+细胞比例（5.06±0.66）低于对照组（20.62±0.99），差异有高度统计学意义（P < 0.001）。两组CD16+CD56+NK细胞比例差异无统计学意义（感染组：10.52±1.71;对照组：7.44±0.64，P > 0.05）。

2.2 两组外周血淋巴细胞亚群绝对值比较

计数单位体积内淋巴细胞数目（单位：个/μL），感染组CD3+、CD8+细胞数目（CD3+：13030±1518;CD8+：9910±1167）。明显高于对照组（CD3+：3948±374;CD8+：1122±134），差异有高度统计学意义（P < 0.001）。感染组CD19+细胞数目（595±74）低于对照组（1220±141），差异有高度统计学意义（P < 0.001）。两组间CD4+T淋巴细胞[CD4+T淋巴细胞：感染组（2057±247）、对照组（2525±265）]及CD16+CD56+NK细胞数目[CD16+CD56+NK细胞：感染组（1120±207）、对照组（653±132）]比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

2.3 两组CD4+T细胞功能比较

与对照组比较，感染组IFN-γ分泌显著增加[感染组：（90.79±13.83）ng/mL;对照组：（57.05±8.72）ng/mL，P < 0.01]，而IL-4分泌减少[感染组：（63.94±18.67）ng/mL;对照组：（117.78±25.56）ng/mL，P < 0.05]。

2.4 两组CD8+T细胞功能比较

与对照组比较，感染组CD8+T细胞穿孔素及颗粒酶B阳性细胞百分比均较对照组有显著增加[CD8+T细胞穿孔素百分比：感染组（31.82±9.48）%、对照组（13.57±5.27）%，P < 0.01;颗粒酶B阳性细胞百分比：感染组（48.36±15.75）%、对照组（27.04±7.81）%，P< 0.05）]。

2.5 感染组CD4/CD8比值与EB DNA载量关系

感染组EBV DNA载量与淋巴细胞亚群CD4/CD8比值变化无相关性（r = 0.19，P > 0.05）。

3 讨论

EBV感染患儿的临床表现具有潜伏性，多样性，可累及多个器官系统，并与一些恶性病变、肿瘤及自身免疫病等密切相关[8]。EBV的靶细胞是B淋巴细胞，病毒外膜蛋白gp350/P220与B淋巴细胞表面受体CD21结合后进入B淋巴细胞，不断复制，继而引起T淋巴细胞大量活化扩增[9-13]。本研究结果显示，EBV感染患儿存在明显的细胞免疫异常，主要表现在免疫细胞比例失衡与功能改变。与对照组比较，感染组CD19+ B细胞明显减少，这主要是与靶细胞被大量杀伤有关;CD3+ T细胞比例和数目增加，其中CD8+ T细胞的改变尤为显著，提示机体细胞免疫激活，T淋巴细胞大量增殖，CD4/CD8比例明显降低。感染组CD16+CD56+ NK细胞绝对值略有升高，但两组差异无统计学意义（P > 0.05），这可能与样本量少有关。

Th1/Th2细胞亚群是CD4+ T淋巴细胞的两种主要效应细胞类型，其在细胞免疫发挥重要作用[14-16]。其中Th1细胞主要分泌细胞因子IFN-γ，介导细胞免疫应答，Th2细胞主要分泌细胞因子IL-4，促进变态反应。本研究结果显示，感染组外周血中PBMC的IFN-γ分泌增加而IL-4分泌减少，提示EBV感染后机体通过增加IFN-γ的分泌上调细胞免疫应答，达到清除病毒的目的。CD8+ T细胞是杀伤靶细胞、参与细胞免疫应答的主力效应细胞，其识别靶细胞后可通过分泌穿孔素在靶细胞膜上打孔，导致细胞渗透压改变，同时颗粒酶B进入细胞引起DNA裂解，细胞死亡[17-19]。本研究显示，EBV感染后CD8+ T淋巴细胞被激活，上调穿孔素及颗粒酶B的表达，杀伤靶细胞，从而达到清除病毒的目的。

实时荧光定量PCR检测EBV DNA是诊断EBV的金指标[20]。通过定量检测机体EBV DNA拷贝数，反映EBV感染和病毒复制情况，并且EBV DNA载量与病情严重程度及预后密切相关[21-23]。本研究发现，EBV感染后，机体CD4/CD8比例会减小甚至倒置，但并不能通过CD4/CD8比例变化程度推测体内EBV DNA拷贝数的多少。

综上所述，EBV感染患儿体内淋巴细胞稳态失衡，细胞免疫应答功能增强。临床对EBV感染儿童除采取积极抗感染措施外，还应密切监视患儿机体免疫情况，尤其是合并免疫功能低下及重症患者，应适当使用免疫调节剂，促进其机体细胞免疫应答，加速机体对EBV的清除，促进患儿康复。

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（收稿日期：2018-11-26  本文编辑：王   蕾）