新发重型再生障碍性贫血患者外周血CD4+CD25+T细胞及其细胞因子表达观察

钟敏,苏群豪，胡敏，徐璐，陶石

(海南医学院第一附属医院,海口570102)

重型再生障碍性贫血(SAA)是一组因造血干细胞损伤导致的骨髓衰竭性疾病[1]。研究证实，SAA的免疫发病机制主要为细胞免疫功能持续异常、自身免疫耐受失调，导致造血干细胞凋亡[2]。CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)被认为在SAA发病中起了极为重要作用[3]。由于Treg能显著调节免疫，有效抑制自身免疫反应，维持机体免疫平衡，因此多种自身免疫疾病发病过程中均存在Treg数量或功能异常。临床研究[4]证实，Treg参与SAA发病，然而Treg以及其他T淋巴细胞亚群与SAA患者的预后是否存在相关性仍未明确[5]。本研究观察了初发SAA及缓解期SAA患者Treg细胞及CD4+T细胞、CD8+T细胞亚群百分比变化，并探讨了Treg与患者预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月～2017年7月海南医学院第一附属医院就诊的SAA患者66例，均符合张之南等编纂的《血液病诊断及疗效标准》[5]。男34例、女32例，年龄32～64(49.6±14.3)岁。纳入标准:患者骨髓单个核细胞的Coomb′s试验为阴性；临床资料齐全，且按照医嘱随访。排除标准:合并有严重的心、肺、肝、肾等重要器官功能不全；罹患其他血液系统性疾病；近期6个月内使用皮质类固醇激素及免疫抑制剂者。66例SAA患者中，新发30例(新发组)，其中男18例、女12例，年龄(54.2±13.4)年,有糖尿病史6例、高血压史8例；SAA经免疫抑制剂初治后恢复(恢复标准:血象恢复，网织红细胞≥20×109/L，血小板≥20×109/L，ANC≥1.0×109/L；骨髓增生活跃，红系及粒系的比例恢复正常，巨核细胞计数≥8个/HP；不需要输血治疗)的患者36例(缓解组)，其中男16例、女20例，年龄(48.3±14.2)岁，有糖尿病史12例、高血压史16例。两组年龄、性别、既往病史等有可比性。

1.2 外周血中Treg、CD4+T细胞、CD8+T细胞检测 两组均在纳入研究后第2天清晨空腹取肘静脉血3～5 mL，加入EDTA抗凝。采用FACS Canto Ⅱ型流式细胞仪(购自美国BD公司)分别检测各组患者外周血中Treg及CD4+T细胞、CD8+T细胞百分比，并计算CD4+T/CD8+T、Treg/CD4+T。

1.3 血清Treg分泌的细胞因子IL-10、IL-35、TGF-β检测 应用细胞分离液分离外周血单个核细胞，再依据免疫磁珠仪使用说明书进行Treg分选，将分选好的Treg以1×106/L浓度接种于24孔板，每组设3个复孔，每孔中加5 mg/mL浓度的植物血凝素予以5%的CO2环境下培养过夜后，收集各组上清液，均应用ELISA法检测IL-10、IL-35以及TGF-β。

1.4 随访 两组研究对象出院后均予以电话或门诊随访，随访时间为4～12个月、中位随访时间10个月。随访期间记录患者血象、Treg及CD4+T细胞、CD8+T细胞百分比、并发症等主要指标，随访结局为死亡或急性复发。复发标准:骨髓细胞增生程度小于正常25%；血象具备三项中两项，如网织红细胞绝对数<20×109/L、血小板绝对数<20×109/L、中性粒细胞绝对值<0.5×109/L。

2 结果

2.1 两组外周血Treg、CD4+T细胞、CD8+T细胞百分比比较及其之间的相关性 与新发组相比，缓解组Treg百分比、CD8+T细胞及Treg/CD4+T高，CD4+T细胞百分比及CD4+T/CD8+T均低(P均<0.05)，见表1。SAA患者Treg百分比与CD4+T细胞、CD4+T/CD8+T呈负相关(r=-0.689，P=0.035；r=-0.724，P=0.029)，与网织红细胞百分比呈正相关(r=0.667，P=0.038)。

表1 两组外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞及Treg百分比

2.2 两组血清IL-10、IL-35以及TGF-β水平比较 缓解组血清IL-10、IL-35及TGF-β水平高于新发组(P均<0.05)，见表2。

表2 两组血清IL-10、IL-35以及TGF-β水平

组别nIL-10IL-35TGF-β新发组30157.9±22.259.4±7.965.5±9.6缓解组36181.3±29.565.3±8.772.6±8.4

2.3 SAA患者预后相关因素 66例SAA患者随访期间死亡22例、急性复发14例。以SAA患者预后为应变量，将外周血CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg、CD4+T/CD8+T、Treg/CD4+及血清IL-10、IL-35以及TGF-β水平为自变量，应用全模型多元Logistic回归分析方法进行回归分析，结果显示Treg及Treg/CD4+T与SAA预后有关(P均<0.05)，见表3。

表3 SAA患者预后相关因素多元Logistic回归分析结果

3 讨论

尽管SAA具体的发病机制仍未完全明确，但是众多临床研究证实SAA是一种CD4+T细胞功能亢进的自身免疫疾病，T淋巴细胞各亚群数量、表型以及免疫功能的变化为该病主要发病机制[1，6]。CD4+T细胞数量增加，CD4+T、CD8+T细胞比例失衡引起免疫偏移，致使造血微环境调节因子失调，最终导致造血功能衰竭[7，8]，而调节CD4+T、CD8+T细胞免疫平衡的关键因素是Treg。研究证实，Treg是一类具有免疫调节作用的CD4+CD25+T淋巴细胞亚群，能有效抑制CD4+T细胞增殖，减少炎性细胞因子分泌，进而维持自身免疫耐受[9,10]。研究[3,9～12]表明，SAA患者外周血循环中Treg数量和功能均存在显著异常。Kordasti等[10]研究发现，SAA患者Treg数量低于轻型再生障碍性贫血患者以及正常人群，并且正常人群CD4+T细胞功能不能被SAA患者Treg所抑制。但是，目前研究重点为SAA患者体内Treg分布及对其他T细胞亚群的影响，尚未有临床报道Treg与SAA患者预后的关系[13]。本研究通过观察SAA患者外周血Treg和CD4+T细胞、CD8+T细胞百分比的变化，并探讨了其与预后的相关性，以此为临床进一步改善SAA患者预后提供循证依据。

本研究结果显示，SAA患者存在T细胞免疫异常，初治期SAA患者体内的CD4+T细胞、CD4+T/CD8+T高于缓解期患者，而CD8+T细胞低于缓解期患者，与既往研究[14,15]结果一致，表明SAA患者CD4+T细胞占主导地位，免疫平衡向正向调控偏移，促进免疫细胞增殖与分化；初治期SAA患者Treg百分比及Treg/CD4+T低，提示SAA患者体内Treg的数量及功能均被抑制，没能起到免疫调节功能。国外研究[16,17]显示，SAA发病机制中主要环节为Treg百分比降低，并且Treg百分比与SAA患者病情程度呈正相关，监测Treg水平能有效评估SAA患者病情变化。进一步研究[18,19]分析显示，初治期患者体内血清的IL-10、IL-35以及TGF-β水平低，而这些细胞因子均是Treg分泌的主要细胞因子，能显著抑制CD4+T细胞活性，提示SAA患者体内的Treg免疫功能被显著抑制。对SAA患者体内Treg百分比与CD4+T细胞、CD8+T细胞以及网织红细胞百分比进行相关分析，结果显示Treg百分比与CD4+T细胞百分比及CD4+T/CD8+T呈负相关，与网织红细胞百分比呈正相关，提示SAA患者体内Treg数量和造血系统恢复有较强相关性，其中的具体调控机制值得继续进行深入研究。进一步应用多元Logistic回归分析，结果显示Treg百分比及Treg/CD4+T与SAA预后有关，表明升高Treg百分比及Treg/CD4+T可能可有效改善SAA患者预后。

综上所述，与缓解期SAA患者比较，新发SAA患者外周血Treg百分比降低。外周血Treg百分比升高提示SAA患者预后良好。Treg细胞及Treg/CD4+T可用于监测SAA患者细胞免疫功能、评估临床预后。然而本研究的纳入病例较少，故此结论仍需要大样本多中心的临床试验来证实。