硫化氢通过上调神经调节蛋白1/ErbB2抑制阿霉素诱导的大鼠心肌纤维化

聂连桂 刘茂军 陈坚 吴倩 谭文婷 刘盛权 褚春 唐芬 龙俊蓉 杨军

(南华大学 1附属第一医院心血管内科，湖南 衡阳 421000;2附属第二医院药剂科)

阿霉素作为一种高效的蒽环类广谱抗肿瘤药物，随着上市后在临床的广泛应用已被证明对人体具有不可逆的时间和剂量依赖性心脏毒性，可导致类似于扩张型心肌病的病变。而心肌纤维化不仅是扩张型心肌病主要的病理变化之一，也是阿霉素诱导扩张型心肌病的病理生理过程中的关键环节〔1，2〕。但目前对于阿霉素诱导心肌纤维化发生的具体机制尚不明确，有研究发现神经调节蛋白(NRG)1/ErbB2信号转导通路与保护心肌、改善心肌纤维化等过程关系密切〔3，4〕，心肌细胞中NRG1可通过激活被称为ErbBs蛋白的受体酪氨酸激酶〔表皮生长因子(EGF)受体的经典成员〕进行一系列的信号转导从而参与心肌纤维化过程〔5〕。硫化氢(H2S)作为一种新型的气体信号分子，其在心血管系统中参与一系列的生物保护效应，已有研究表明H2S在动物模型中具有保护心肌，改善心肌纤维化的作用〔6，7〕。但目前对于H2S是否具有改善阿霉素诱导的大鼠心肌纤维化的作用及其内在调控机制均尚不明确。本研究观察H2S对阿霉素诱导的大鼠心肌纤维化及NRG1、ErbB2蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性成年SD大鼠40只，体重取180～200 g，购于长沙斯莱克动物实验中心；饲养于温度适宜(22±2)℃的恒定环境中，昼夜各12 h，大鼠均可自由进食，饮水；分笼饲养，定期消毒。

1.2主要实验试剂 阿霉素购于美仑生物公司；NRG1和ErbB2一抗、抗兔二抗购于中国武汉博士德生物有限公司；GAPDH一抗(兔源)购于中国晶欣生物公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒和细胞裂解液购于中国碧云天生物公司；硫氢化钠(NaHS,H2S供体)购于美国Sigma公司；Masson染色试剂盒购于中国迈新生物技术开发公司。

1.3动物模型的建立 将40只SD大鼠置于恒温环境下适应性饲养1 w后随机分为对照组、模型组、H2S模型组、H2S对照组，每组各10只。模型组和H2S模型组采用2 w分6次腹腔注射阿霉素，剂量为3 mg/(kg·次)(注射前用生理盐水稀释至0.5 mg/ml，造模2 w总剂量为18 mg/kg)造模，对照组及H2S对照组予以同等剂量的生理盐水腹腔注射共6次。2 w后，H2S模型组及H2S对照组给予NaHS〔56 μmol/(kg·d)，溶于1 ml生理盐水中，使用前新鲜配制〕腹腔注射，对照组和模型组使用同等剂量的生理盐水腹腔注射。建模8 w后，将所有大鼠麻醉后处死。

1.4Masson染色观察心肌纤维化沉积 取各组左室心肌组织，置于10%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，制成切片〔(3±1)mm〕，严格按照说明书步骤开始Masson染色；随后在40×10倍镜下选取不同视野，每个标本选取5个视野，观察染色区域的胶原纤维染色面积，比较各组胶原沉积情况。

1.5Western印迹检测心肌组织中NRG1和ErbB2蛋白的表达 取各组左室心肌组织，提取蛋白后经BCA比色法定量；取蛋白样本经99℃煮10 min；严格按照说明书比例配置10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离胶置于电泳缓冲液中电泳；取目的条带进行转膜；Tween-20 Tris-盐酸缓冲液(TBST)封闭；经NRG1和ErbB2及GAPDH一抗(稀释度为1∶1 000)37℃孵育后置4℃过夜；经TBST洗膜后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗(稀释度为1∶2 000)37℃孵育后；再经TBST洗膜；电化学发光(ECL)显影；曝光，扫描；经Image J软件对靶蛋白条带进行光密度分析。取GAPDH一抗为内参，将目的条带与内参灰度比值分别表示NRG1和ErbB2蛋白表达水平。

1.6统计方法 采用SPSS18.0软件进行方差齐性检验及单因素方差分析。

2 结 果

2.1大鼠存活情况 8 w后，共存活33只SD雄性大鼠，其中对照组10只、模型组6只、H2S模型组7只、H2S对照组10只。

2.2各组心肌纤维化沉积 镜下观察胶原纤维染呈蓝色。模型组心肌纤维沉积较对照组显著增加(P<0.05)；H2S模型组心肌组织纤维沉积较模型组显著减少(P<0.05)。H2S对照组与对照组相比无明显差异。见图1。

图1 各组心肌纤维化沉积(Masson染色，40×10)

2.3各组心肌组织NRG1蛋白表达 与对照组(0.95±0.019)比较，模型组心肌组织NRG1蛋白表达(0.72±0.116)显著降低(P<0.05)；H2S模型组心肌组织NRG1蛋白表达(1.02±0.045)较模型组显著升高(P<0.05)；对照组与H2S对照组NRG1的表达(1.03±0.047)无明显差别(P>0.05)。见图2。

2.4各组心肌组织ErbB2蛋白表达 与对照组(0.91±0.019)比较，模型组心肌组织ErbB2蛋白表达(0.61±0.115)显著降低(P<0.01)；H2S模型组心肌组织ErbB2蛋白表达(0.89±0.015)较模型组显著升高(P<0.01)；对照组与H2S对照组ErbB2表达(0.80±0.054)无明显差别(P>0.05)。见图2。

图2 各组NRG1和ErbB2蛋白表达水平

3 讨 论

阿霉素作为一种高效的蒽环类抗肿瘤药物，通过与拓扑异构酶Ⅱ结合，可破坏DNA的三级结构，抑制RNA和DNA的合成，从而发挥其抗肿瘤效应。然而，阿霉素抗肿瘤治疗的同时在一定程度上也对正常细胞，尤其是心肌细胞具有极强的杀伤作用〔8〕。有实验证明阿霉素可以导致心肌细胞凋亡〔1〕，而心肌细胞凋亡可导致心脏成纤维细胞增生并转化为肌成纤维细胞，使细胞外基质沉积增加，从而发生心肌纤维化〔9〕。本研究与文献〔9〕报道类似，说明采用腹腔注射阿霉素可导致大鼠明显的心肌纤维化。研究显示氧化应激、自身免疫等可能参与阿霉素导致心肌纤维化的发生机制，但具体的调控机制目前尚不十分明确〔10〕。NRG1/ErbB系统是一种调节心脏功能和适应的内皮控制的旁分泌系统。NRG1是一类含有EGF样结构域的神经营养和肿瘤抑制因子，广泛分布于中枢神经系统和心肌细胞中。NRG1的EGF样结构域与受体ErbB蛋白结合并激活受体的酪氨酸激酶活性，从而触发下游信号通路，激活一系列细胞内生物学级联反应。NRG1受体包括 ErbB2、ErbB3及ErbB4〔3〕，成熟心肌细胞中表达ErbB4和ErbB2，NRG1与ErbB4高亲和力捆绑，在心肌细胞中NRG1优先与ErbB2发生二聚反应，进而通过跨膜螺旋结构和细胞内的激酶域活化发生信号转导〔8〕。NRG1从心脏微血管内皮细胞释放，通过在心肌细胞中表达的ErbBs作为旁分泌因子调节心脏发育和应激反应。研究显示NRG1/ErbB信号转导通路参与心肌纤维化发生机制〔11，12〕，也有研究表明，心脏中高表达NRG1可以保护心肌细胞，而阿霉素能明显减少 NRG和ErbB表达〔13〕。本研究提示NRG1/ErbB2信号通路可能参与阿霉素导致的心肌纤维化调控机制。

H2S分子作为一种具有广泛生理功能的气体信号分子，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用，已有文献阐述了H2S可通过保护线粒体功能、降低内质网应激反应、抑制炎性反应等机制减少心肌细胞凋亡从而发挥心肌保护作用〔14〕。而H2S对心肌纤维化的改善作用已在糖尿病心肌病、甲状腺功能亢进性心肌病等多个模型中被证明〔6，15〕。同时，研究发现NRG1/ErbB2信号通路参与多种病理生理过程，与慢性心力衰竭、急性心肌梗死等多种心血管疾病的发生发展密切相关〔3，4〕。在糖尿病心肌病等以心肌纤维化为病理改变为基础的心肌病模型中已证明，NRG1/ErbB信号系统在维持心功能及逆转心肌重塑中发挥关键性作用〔16〕。本研究提示H2S改善阿霉素诱导的大鼠心肌纤维化的机制可能与上调NRG1和ErbB2的表达有关。提示H2S可能通过上调NRG1/ErbB2通路抑制阿霉素诱导的心肌纤维化，但其具体信号调控机制仍需进一步研究。