姜黄素对HaCaT细胞增殖、凋亡及KLF6/p21蛋白表达的影响

王智杰王 磊 郑益志

银屑病（psoriasis）是一种慢性炎症性皮肤疾患。目前用来治疗银屑病的药物主要受到耐药性及给药途径的影响[1]。研究表明，过度表达KLF6（Kruppellike factor 6）基因的肿瘤细胞出现显著凋亡，并伴有p21mRNA及蛋白质表达上调，KLF6通过上调p21来促进细胞凋亡[2]。姜黄素具有抗氧化、抗肿瘤、抑制炎症反应等生物学作用，研究表明，姜黄素浓度依赖性的促进HaCaT细胞的凋亡[3]。本研究选用外源性血管内皮生长因子（VEGF）刺激HaCaT细胞模拟银屑病体外增殖模型，选用姜黄素来抑制VEGF促HaCaT细胞增殖作用，观察处理后KLF6、p21蛋白表达情况，对KLF6/p21信号通路与银屑病的相关性进行实验研究，现报道如下。

1 实验材料

1.1 药 物 姜黄素（规格：1g，美国Sigma公司130823）。

1.2 试剂与仪器 VEGF（英国abcam公司）、胎牛血清（140112）（杭州四季青有限公司）、二甲基苯酚（131115）（天津天河化学试剂厂）、CCK-8（130926）（美国sigma公司）、蛋白酶抑制剂（140218）（美国sigma公司）、兔多克隆KLF6抗体及小鼠单克隆p21抗体（140129）（英国abcam公司）、生物素标记二抗（131225）(美国 Jackson公司)、细胞凋亡试剂盒（131130）（杭州联科生物有限公司）、倒置显微镜（XPS-18）（COIC 公司）、超净工作台（SW-II-A/B3）（上净净化公司）、CO2培养箱（3111）（Thermo Forma公司）、冷冻高速离心机（CL17R）（Thermo Forma公司）、低温高速离心机（CL31R）（Thermo Forma公司）、流式样细胞仪（FC500）（贝克曼公司）。

2 实验方法

2.1 HaCaT培养 HaCaT细胞在5%CO2，37℃恒温条件下培养于含高糖DMEM培养液（含10%胎牛血清）的无菌培养瓶中，于倒置显微镜下密切观察HaCaT细胞生长情况。细胞融合约瓶底70%～80%的状态时，弃去原培养液，PBS洗涤2～3次后加入适量胰酶。37℃孵育至HaCaT细胞收缩变圆、细胞间隙明显增宽，在超净台中加入适当细胞培养液终止其消化，反复吹打使贴壁细胞悬浮于培养基中。将培养瓶中的细胞悬液转移至15mL离心管，800r/min离心5min，然后收集细胞。加入新的培养液，反复轻轻吹打至细胞均匀悬浮，以1：3的比例接种于细胞培养瓶中静置。

2.2 CCK-8实验（Cell Counting Kit-8） 收集HaCaT细胞，计数并按每孔1×104个细胞浓度接种至96孔板中，每组设5个复孔，边缘用无菌PBS填充。每孔加入100μL用无血清1640培养液稀释的含有不同浓度的姜黄素（0，5，10，15，20，30，40umol/L），将培养板放在培养箱中孵育24h（37℃，5%CO2的条件下）。向每孔加入10μL的CCK-8溶液。将培养板在培养箱内孵育1～4h。用酶标仪检测其在450nm值处的吸光度。待细胞长满96孔板板底约60%时，将其移出培养基，用无菌PBS洗涤两次；每孔加入100μL用无血1640稀释的姜黄素和VEGF，本实验设四组：空白对照组，20μmol/L姜黄素组，25ng/mLVEGF组，25ng/mLVEGF联合20μmol/L姜黄素组，继续孵育24h。

2.3 免疫印迹技术（Western Blot） 取处在其对数生长期的HaCaT细胞，加入RIPA细胞裂解液300μL，冰上裂解 30min，12000r/min 离心 10min，提取蛋白行SDS-PAGE电泳、将蛋白转移至PVDF膜上，室温下封闭1h，按1：1000比例用封闭液分别稀释KLF6、p21、β-actin 抗体，4℃条件下旋转孵育过夜，二抗室温下常温旋转孵育 2h，TBST洗膜 3次（10min/次），ECL试剂盒孵育后暗盒曝光。

图1 VEGF联合姜黄素对HaCaT细胞P21蛋白表达的影响

图2 VEGF联合姜黄素对HaCaT细胞KLF6蛋白表达的影响

图3 姜黄素和VEGF对HaCaT细胞凋亡的影响

2.4 流式细胞技术 取处于对数生长期的HaCaT细胞，待细胞长至细胞培养瓶底部约60%～70%时移出培养基，无菌PBS洗涤2次。每瓶加入等体积无血清1640稀释的姜黄素或（和）VEGF，孵育24h。用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶将HaCaT细胞消化，收集细胞至离心管中，1000r/min离心5min，弃去培养液。用预冷的PBS洗涤2次，1000r/min离心5min，弃去PBS。细胞沉淀加入适量预冷的1XBinding Buffer重悬，使细胞浓度为 1×106～1×107个细胞/mL。每个样品管中加入 100uL细胞悬液，约 1×105～1×106个细胞/每管。每管加入5μL Annexin V-PE和10μL 7-AAD。轻柔涡旋混匀后，室温下避光静置15min。无需洗涤，每管加入380μL预冷的1XBinding Buffer，流式细胞分析细胞凋亡。

2.5 统计学方法 使用SPSS17.0软件进行统计，计量资料以均数±标准差（±s） 表示，各组间计量资料的比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD法。组间比较采用独立样本的t检验，相关性采用Pearson分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 细胞增殖情况 姜黄素在0～40μmol/L内浓度依赖性的抑制HaCaT细胞增殖，20μmol/L的姜黄素对 HaCaT细胞有明显的抑制作用（P＜0.01），在0～40μmol/L范围内HaCaT细胞增殖与姜黄素浓度呈线性相关（r=-0.92，P＜0.01）。见表1；与空白对照组相比，25ng/mLVEGF对HaCaT细胞有明显的促增殖作用（P＜0.05），20μmol/L姜黄素可明显抑制 HaCaT细胞增殖；20μmol/L姜黄素明显抑制 25ng/mL VEGF对 HaCaT细胞的促增殖作用（P＜0.01）。见表2。

表1 不同浓度姜黄素对HaCaT细胞凋亡的影响（n=7，±s）

表1 不同浓度姜黄素对HaCaT细胞凋亡的影响（n=7，±s）

注：t值为不同姜黄素浓度与空白对照组（姜黄素浓度为0μmol/L）比较

姜黄素浓度（umol/L）t值P值0 5 1 0 15 20 30 40吸光度值0.853±0.083 0.844±0.026 0.830±0.044 0.575±0.118 0.336±0.370 0.262±0.030 0.260±0.018 0.215 0.545 4.280 12.708 14.984 15.635＞0.05＞0.05＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

表2 姜黄素和VEGF对 HaCaT细胞增殖的影响（n=4，±s）

表2 姜黄素和VEGF对 HaCaT细胞增殖的影响（n=4，±s）

注：*：与空白对照组比较；△：与 25ng/mL VEGF组比较；VEGF：血管内皮生长因子

组别空白对照组25ng/mLVEGF组20μmol/L姜黄素组25ng/mLVEGF+20μmol/L姜黄素组吸光度值0.866±0.067 0.981±0.061*0.345±0.047*0.419±0.089△t值P值-2.853 14.231 11.624＜0.05＜0.01＜0.01

3.2 免疫蛋白印迹结果 与空白对照组比较，25ng/mL VEGF可上调HaCaT细胞p21蛋白表达，20μmol/L姜黄素组可下调其KLF6，p21蛋白表达，20μmol/L姜黄素组能抑制25ng/mLVEGF组对HaCaT细胞KLF6，p21蛋白的上调作用，本实验重复3次，结果相似，见插页图1-2。

3.3 流式细胞仪试验结果 与空白对照组比较，20μmol/L姜黄素组可明显促进HaCaT细胞凋亡；与25ng/mL VEGF组比较，20μmol/L姜黄素组可明显促进25ng/mLVEGF影响下的HaCaT细胞凋亡，本实验重复3次，结果相似，见插页图3。

4 讨论

银屑病是一种常见的慢性炎症性复发性皮肤疾患治疗主要采用局部疗法或局部和全身疗法结合的方法[4]。VEGF在银屑病皮损中存在高水平表达情况[5]。VEGF抑制剂通过阻碍VEGF信号通路可能成为治疗银屑病的一种新方法[6]。

KLF6参与细胞增殖、凋亡、生长、分化等过程，KLF6在多种组织中普遍表达。它的失活或表达异常参与了多种肿瘤的发生发展，并在细胞的增殖、凋亡、分化和发育中扮演着重要的角色[7]。p21基因对细胞周期有明显的负性调控作用，能够参与细胞的多种生物功能活动，既能抵抗凋亡，又能促进凋亡、抑制增殖[8]。p21基因是KLF6基因的直接靶基因，野生型KLF6基因有不依赖p53介导上调p21的作用，从而显著降低细胞增殖[9]。

姜黄素安全系数高，连续4个月服用姜黄素3600～8000mg除见轻微的呕吐和腹泻，未见其他明显副反应[10]，姜黄素具有明显的抗炎及抗细胞增殖作用[11]，现已用于多种银屑病等皮肤科疾病的治疗，且取得良好的临床疗效。

本实验选取 0、5、10、15、20、30、40μmol/L 的浓度梯度进行相关研究，发现姜黄素在0～40μmol/L范围内呈浓度依赖性促进HaCaT细胞凋亡，20μmol/L姜黄素明显促进HaCaT细胞凋亡。与空白对照组相比，25ng/mL VEGF组能明显促进HaCaT细胞KLF6/p21蛋白表达；20μmol/L姜黄素可有效抑制HaCaT细胞的KLF6/p21表达水平，还可下调25ng/mLVEGF对HaCaT细胞KLF6/p21的促表达作用。据此推测KLF6可能通过正性调节p21的表达来参与银屑病的发病，姜黄素可通过下调KLF6/p21表达水平抑制HaCaT细胞增殖局部炎症反应，从而达到治疗银屑病的目的。