电子束辐照对带鱼鱼糜内源性蛋白酶活性及其构象单元的影响

罗华彬，林 露，高 星，吕梁玉，李高尚，陈燕婷，张进杰，杨文鸽*

（宁波大学食品与药学学院，浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室，浙江 宁波 315211）

在热诱导鱼糜凝胶的形成过程中，当通过40～60 ℃温度带时鱼糜蛋白往往会发生严重降解，形成低弹性鱼糜凝胶，甚至不能形成凝胶，这种凝胶劣化现象与鱼糜内源性蛋白酶的活性有关，肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（myofibril-bound serine proteinase，MBSP）和组织蛋白酶L（cathepsin L，Cat-L）等蛋白酶均会促使鱼糜肌原纤维蛋白水解及肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）降解，影响鱼糜凝胶形成[1-2]。如鲤鱼肌原纤维与纯化的丝氨酸蛋白酶在55 ℃反应1 h，MHC、α-辅肌动蛋白和肌动蛋白均被降解，鱼糜凝胶劣化，并发现在鲤鱼鱼糜中加入Cat-L会降低鱼糜凝胶强度，而同时加入Cat-L及其抑制剂，凝胶强度则会增加，说明丝氨酸蛋白酶和Cat-L均是导致鱼糜凝胶劣化的关键酶类[3]。Jiang等[4]认为残留在鲭鱼鱼糜中的Cat-L可以降解肌球蛋白，引起鲭鱼鱼糜凝胶劣化；揭珍等[5]在不同温度下保温带鱼鱼糜，发现在50～75 ℃时肌原纤维蛋白重链被降解，三氯醋酸-溶解肽含量增加，并在70 ℃时达到最高值，导致带鱼鱼糜凝胶劣化。

作为较新兴的食品冷杀菌技术，电子束辐照凭借其能减少农产品产后损失、提高食品加工品质、控制食源性疾病发生等优势而越来越受到世界各国人们的重视[6-7]。研究表明，电子束辐照对食品蛋白等生物大分子具有独特的改性作用，能引起蛋白化学作用力及其构象的改变，导致蛋白变性、聚集或凝胶化，同时也能改变鱼糜内源性蛋白酶的结构及其活性，从而影响鱼糜凝胶的形成[8-9]。如Jaczynski等[10]研究了电子束辐照剂量对狭鳕鱼鱼糜蛋白结构及其凝胶特性的影响，发现鱼糜蛋白的疏水性及二硫键含量、凝胶剪切力均随辐照剂量的增加而增加，6～8 kGy辐照可有效改善狭鳕鱼鱼糜凝胶品质；Lin Xianping[11]、Deng Siyao[12]等分别对带鱼鱼糜和梅鱼鱼糜进行电子束辐照，发现辐照引起鱼糜肌原纤维蛋白α-螺旋含量降低，β-折叠、β-转角和无规卷曲含量升高，5～7 kGy辐照可以显著提高鱼糜凝胶强度，促进凝胶网络结构的形成。为进一步阐述电子束辐照对鱼糜凝胶特性的影响机理，本研究以不同剂量电子束辐照带鱼鱼糜，提取各组鱼糜内源性MBSP和Cat-L，测定其活力及最适反应温度，通过圆二色光谱分析其二级结构，探究电子束辐照对带鱼鱼糜MBSP和Cat-L的影响，旨在为辐照技术应用于鱼糜及其制品的生产提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冷冻带鱼鱼糜（贮藏于－20 ℃） 宁波飞日水产实业有限公司；Boc-Phe-Ser-Arg-MCA、Z-Phe-Arg-MCA日本Peptide Institute公司；十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美国Sigma公司；其余试剂均为分析纯 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

XHF-D高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；ML104/02型电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Biofuge Stratos台式高速冷冻离心机德国Thermo Scientific SORVALL公司；SpectraMax i3多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司；NBL-1020电子直线加速器 宁波超能科技股份有限公司；J-1500-150圆二色光谱仪 日本JASCO公司。

1.3 方法

1.3.1 鱼糜辐照处理

将冷冻带鱼鱼糜300 g/袋真空包装，利用NBL-1020型电子直线加速器（能量10 MeV）进行辐照，辐照剂量分别为0、1、3、5、7、9 kGy，辐照剂量误差小于3%，其中0 kGy为对照组。每组剂量设置3 个平行，辐照时各个样品排列整齐，防止叠压造成平行样品之间的差异。对照组和各辐照组鱼糜用于MBSP和Cat-L的提取，同时对照组鱼糜用于肌原纤维蛋白的提取。

1.3.2 酶的提取

1.3.2.1 MBSP的提取

参考Cao Minjie等[13]的方法略作修改。取各组鱼糜适量，加入3 倍体积20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.5）匀浆，8 000 r/min冷冻离心20 min。沉淀加入4 倍体积蒸馏水，调至pH 6.0，离心，重复3 次。沉淀加入4 倍体积蒸馏水，调至pH 6.0，55 ℃温育5 min，10 000 r/min冷冻离心20 min。上清液调至pH 4.0，再次离心取上清液，调至pH 6.0，20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.5）透析，冷冻干燥，低温保存。

1.3.2.2 Cat-L的提取

参考Hu Yaqin等[14]的方法略作修改。取各组鱼糜适量，加入4 倍体积50 mmol/L磷酸盐缓冲液A（pH 6.8），匀浆，3 000 r/min冷冻离心10 min，重复2 次。沉淀加入3 倍体积50 mmol/L磷酸盐缓冲液B（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.5）提取20 h，10 000 r/min冷冻离心30 min。上清液加10 倍体积蒸馏水，调至pH 6.8，3 000 r/min离心10 min。沉淀用50 mmol/L磷酸盐缓冲液C（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.0）溶解，50 ℃保温15 min，10 000 r/min冷冻离心20 min取上清液，用质量分数80%硫酸铵沉淀，同时调至pH 5.5，静置10 min后10 000 r/min冷冻离心10 min。沉淀用50 mmol/L磷酸盐缓冲液D（含5 mmol/L L-半胱氨酸，pH 5.5）溶解，透析后10 000 r/min冷冻离心10 min取上清液。冷冻干燥，低温保存。

1.3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离肌原纤维蛋白

鱼糜肌原纤维蛋白的提取：参考Xiong Guangquan等[15]的方法略作修改。取2 g对照组鱼糜，加20 mmol/L Tris-maleate缓冲液（含0.05 mol/L KCl，pH 7.0）20 mL，充分匀浆后10 000 r/min离心15 min，沉淀加入20 mmol/L Tris-maleate缓冲液（含0.6 mol/L KCl，pH 7.0）20 mL，充分匀浆，静置提取1 h后10 000 r/min离心15 min，上清液即为鱼糜肌原纤维蛋白溶液。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：将提取的MBSP、Cat-L分别配制成0.1 mg/mL酶液，各加5 mL 5 mg/mL肌原纤维蛋白溶液，55 ℃反应10 min，得到肌原纤维蛋白酶解液。参照Laemmli[16]的方法进行SDS-PAGE，分离胶和浓缩胶质量分数分别为10%和5%，酶解液上样量10 µL，起始电压80 V，溴酚蓝指示剂进入分离胶后电压改为100 V。考马斯亮蓝R-250染色，凝胶成像系统拍照分析。

1.3.4 酶活力的测定

1.3.4.1 MBSP活力的测定

参考Cao Minjie等[17]的方法。将MBSP溶于蒸馏水中，取MBSP溶液50 μL，依次加入900 μL 50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）和50 μL 10 μmol/L荧光底物，摇匀，55 ℃水浴加热10 min，加入1.5 mL终止液（V（甲醇）∶V（正丁醇）∶V（蒸馏水）＝35∶30∶35）终止反应。酶标仪测定荧光强度，激发光和发射光波长分别为380 nm和450 nm。以每分钟反应生成1 mmol 7-氨基-4-甲基香豆素所需的酶量为1 个酶活力单位（U/g）。

1.3.4.2 Cat-L活力的测定

参考Barrett等[18-19]的方法略作改动。将Cat-L溶于蒸馏水中，取Cat-L溶液50 μL，依次加入900 μL乙二胺四乙酸-乙酸钠缓冲液（4 mmol/L乙二胺四乙酸、0.4 mol/L乙酸钠，pH 5.5，含20 mmol/L半胱氨酸和50 μL底物（10 μmol/L Z-Phe-Arg-MCA）），摇匀，55 ℃水浴加热30 min，加入3.0 mL 0.1 mol/L氯乙酸钠-乙酸缓冲液（pH 4.5）终止反应。酶标仪测定荧光强度，激发光和发射光波长分别为370 nm和460 nm。以每分钟反应生成1 nmol 7-氨基-4-甲基香豆素所需的酶量为1 个酶活力单位（U/g）。

1.3.5 MBSP、Cat-L最适反应温度的测定

参考1.3.4节的方法测定酶活力。反应温度分别设置为25、35、45、55、65、75、85 ℃，测定不同温度下MBSP、Cat-L活力，确定辐照对MBSP、Cat-L最适温度的影响。

1.3.6 圆二色光谱测定MBSP、Cat-L的二级结构

参照Lee等[20]的方法略作修改。分别配制0.02 mg/L M B S P、C a t-L溶液，以蒸馏水为空白对照，在190～250 nm波长范围进行光谱扫描，选用1 mm比色皿，测定温度25 ℃，扫描速率50 nm/min，响应时间0.25 s，每组样品重复扫描3 次，累加得到圆二色光谱图，图谱经过仪器本底消除和溶液空白差减。利用仪器自带软件分析MBSP、Cat-L各二级结构单元的相对含量。

1.4 数据统计与分析

实验设置3～6 个平行，数据用fs表示，采用Origin 9.0软件作图，采用SPSS 19.0软件中的Duncan检验进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 辐照对鱼糜MBSP、Cat-L活力的影响

图1 电子束辐照对鱼糜MBSP和Cat-L活力的影响Fig.1 Effect of electron beam irradiation on the activity of MBSP and Cat-L from surimi

如图1所示，与对照组相比，辐照后MBSP活力显著下降，为对照组的87.60%～82.64%，但辐照剂量对其影响不显著。除1 kGy组Cat-L活力与对照组接近外，其余各剂量组Cat-L活力下降显著，尤其是9 kGy组Cat-L活力只有对照组的52%。电子束辐照所产生的高能射线作用于食品组织中的水而产生—H、—OH等活性自由基，从而使蛋白质等大分子物质发生断裂、交联等现象，改变蛋白质的表面疏水性、羰基及巯基含量，影响其生化特性。顾可飞[21]研究了电子束辐照对液态多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力的影响，他认为PPO活力随辐照剂量的增加而降低，在辐照剂量为4.83 kGy和8.69 kGy时，PPO活力分别下降了53%和85%，辐照在一定程度上抑制了PPO活力。马艳萍等[22]利用60Co-γ射线辐照鲜食核桃，发现0.5 kGy辐照能明显提高核桃冷藏期超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活力，抑制过氧化物酶、脂肪氧合酶活力。可见，辐照对酶活力的影响与辐照剂量及酶的种类有关。MBSP和Cat-L属于蛋白质，辐照导致其活力降低与其结构变化有关。

2.2 辐照对鱼糜MBSP、Cat-L最适温度的影响

图2 辐照剂量和反应温度对鱼糜MBSP活力的影响Fig.2 Effect of irradiation doses and reaction temperatures on the activity of MBSP from surimi

图3 辐照剂量和反应温度对鱼糜Cat-L活力的影响Fig.3 Effect of irradiation doses and reaction temperatures on the activity of Cat-L from surimi

由图2、3可知，随温度升高，MBSP和Cat-L活力均先升高后降低。各组鱼糜MBSP的最适温度均为55 ℃，对照组和1 kGy组鱼糜Cat-L的最适温度为55 ℃，5 kGy及7 kGy组Cat-L的最适温度在45～55 ℃之间，但3 kGy及9 kGy辐照对Cat-L的最适温度产生影响，使其由55 ℃降低至45 ℃。鲍晓瑾[23]、Cao Minjie[13]等分别发现鳙鱼和狗母鱼MBSP的最适温度均为50 ℃；胡亚芹等[24]发现南蓝鳕鱼糜Cat-L的最适温度为45 ℃；从海参体表纯化到的Cat-L的最适温度为50～60 ℃[25]。本研究中2 种酶的最适温度与上述结果接近，电子束辐照没有改变带鱼鱼糜MBSP的最适温度；随剂量的增加，Cat-L的最适温度略有降低，但均在容易引起鱼糜凝胶劣化的温度带40～60 ℃范围内，表明MBSP和Cat-L均有潜在的引起凝胶劣化能力。揭珍等[5]研究了温度对带鱼鱼糜肌原纤维蛋白的降解作用，认为在50～75 ℃时肌原纤维蛋白重链被降解，70 ℃时溶解肽含量达最高值，也和本研究MBSP和Cat-L在65～75 ℃时仍有较高活力的结果一致。

2.3 辐照对鱼糜MBSP、Cat-L降解肌原纤维蛋白作用的影响

图4 辐照对MBSP降解肌原纤维蛋白作用的影响Fig.4 Effect of irradiation on the myof i brillar protein degradation of MBSP

图5 辐照对Cat-L降解肌原纤维蛋白作用的影响Fig.5 Effect of irradiation on the myof i brillar protein degradation ability of Cat-L

MBSP和Cat-L能有效降解肌原纤维中的MHC，而MHC的降解被认为是导致凝胶劣化的主要因素。分别用各组鱼糜中提取的MBSP、Cat-L作用于肌原纤维蛋白，进一步利用SDS-PAGE进行分离，结果见图4、5。图5中对照组和1 kGy组中未见MHC条带，但随着辐照剂量的增加，图4、5中的MHC条带灰度明显增加，尤其是9 kGy组，说明辐照减弱了鱼糜MBSP和Cat-L对肌原纤维蛋白的降解作用；且相对于MBSP，Cat-L活性受辐照的影响更大。Jaczynski等[10]的研究发现辐照剂量越高，MHC的条带越浅；Lin Xianping等[8]认为随着辐照剂量增加至7 kGy和9 kGy，带鱼鱼糜MHC降解较为明显。说明辐照既能直接引起鱼糜肌原纤维蛋白的降解，同时又能削弱鱼糜MBSP和Cat-L对肌原纤维蛋白的降解，选择合适的辐照剂量可以减轻肌原纤维蛋白被降解的程度，以促进鱼糜形成凝胶。

2.4 辐照对MBSP、Cat-L二级结构的影响

蛋白质的二级结构是多肽链借助氢键进行盘旋或折叠而形成的周期性有规律的构象，主要包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲4 种构象单元。基于蛋白质不同类型构象单元吸光度的不同，圆二色光谱被广泛应用于蛋白二级结构的测定。对照组和各辐照组鱼糜MBSP、Cat-L的圆二色光谱图如图6、7所示。

图6 MBSP的圆二色光谱图Fig.6 Circular dichroism spectra of MBSP

图7 Cat-L的圆二色光谱图Fig.7 Circular dichroism spectra of Cat-L

图8 MBSP的二级结构相对含量Fig.8 Relative contents of secondary structures in MBSP

图9 Cat-L的二级结构相对含量Fig.9 Relative contents of secondary structures in Cat-L

由图8可知，辐照后鱼糜MBSP分子中的α-螺旋和无规卷曲的相对含量下降，β-折叠相对含量增加，β-转角相对含量除5 kGy组外变化不明显；随着辐照剂量的增加，MBSP分子中α-螺旋相对含量先减少后增加，β-折叠相对含量的变化则相反，至5 kGy时α-螺旋相对含量最小（31.00%），而β-折叠相对含量最大（21.70%）。由图9可知，随着辐照剂量的增加，Cat-L分子中α-螺旋相对含量的变化趋势与MBSP一致，5 kGy时α-螺旋相对含量最小（26.90%），β-折叠和β-转角相对含量的变化没有明显规律，而无规卷曲的相对含量除9 kGy组外其余均略有上升。

总体上，低剂量辐照（不超过5 kGy）可以促使两种酶中的α-螺旋结构向其他结构转化，而辐照剂量增加至7 kGy时α-螺旋相对含量又有回升。维持酶蛋白二级结构的作用力主要为氢键，电子束辐照会引起氢键断裂又重新形成，使二级结构的构象单元不断互相转变，而构象单元的变化引起空间结构的改变，最终影响其催化活性。吴烨[26]用圆二色光谱测定兔肌球蛋白的二级结构，发现在加热过程中α-螺旋转变成β-折叠和无规卷曲；Malik等[27]的研究发现辐照作用于向日葵蛋白，引起α-螺旋含量降低和β-折叠含量增加；顾可飞[21]的研究表明在辐照剂量低于4.83 kGy时，PPO α-螺旋、β-折叠和β-转角相对含量变化不大，当辐照剂量超过4.83 kGy时，随着剂量的增加，α-螺旋、β-折叠和β-转角含量不断下降，而无规卷曲含量上升；邓思瑶等[9]发现与未辐照鱼糜相比，5 kGy辐照后鱼糜蛋白α-螺旋含量下降，β-折叠和无规卷曲含量上升，而β-转角含量无明显变化，辐照处理使肌原纤维蛋白分子间氢键及分子间相互作用逐渐减弱；Herrero等[28]利用拉曼光谱研究了0～8 kGy电子束对鲑鱼鱼肉蛋白质二级结构的影响，发现8 kGy组鱼肉蛋白的二级结构发生明显改变，其中α-螺旋比例显著下降，β-折叠、β-转角和无规卷曲比例增加；Lee等[20]采用圆二色光谱法分析γ射线对肌红蛋白分子特性的影响，研究表明随辐照剂量的升高，肌红蛋白α-螺旋含量降低的同时无规卷曲含量升高；Moon等[29]采用圆二色光谱研究发现随着辐射时间的延长或强度的增加，蛋白质有序结构的破坏更加明显；Guan Aiyan等[30]发现电子束辐照使中华管鞭虾原肌球蛋白分子中的α-螺旋含量减少，而β-折叠和无规卷曲含量增加，导致其免疫原性的下降。可见，辐照对大多数蛋白来说会破坏其有序的构象单元，改变其构象单元的相对含量。本实验中，当辐照剂量在5 kGy及以下时，鱼糜MBSP和Cat-L分子中稳定的α-螺旋结构相对含量下降的同时，无规卷曲相对含量变化较小，而β-折叠相对含量升高。可见辐照对蛋白二级结构的影响与剂量及蛋白种类有关，二级结构的改变会影响其生物学功能。

3 结 论

电子束辐照处理引起带鱼鱼糜内源性MBSP、Cat-L二级结构的变化，辐照后鱼糜MBSP、Cat-L分子中的α-螺旋相对含量下降，从而影响其空间结构和稳定性，导致MBSP和Cat-L活力降低，并一定程度上降低了MBSP和Cat-L对带鱼鱼糜肌原纤维蛋白的降解；电子束辐照没有改变带鱼鱼糜MBSP的最适温度，3 kGy及9 kGy辐照后鱼糜Cat-L的最适温度略有降低，但各组MBSP和Cat-L的最适温度均在引起凝胶劣化的温度带（40～60 ℃）范围内，而且在高温下仍有较高活力，因此在热诱导鱼糜凝胶形成过程中仍应避开这一温度带，以免引起凝胶劣化。