腊牛肝加工过程中挥发性风味物质变化分析

徐欢，郑娅,2，余群力*，林梁，曹晖，韩明山

1(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070)2(甘肃省农业科学院，甘肃 兰州，730070) 3(甘肃祁连牧歌食品工业股份有限公司，甘肃 张掖，734000) 4(陕西秦宝牧业发展有限公司，陕西 宝鸡，721000)5(内蒙古科尔沁股份有限公司，内蒙古 通辽，028000)

牛肝是牛体储存养料的重要器官，含有丰富的活性物质和人体所需的维生素和矿物质[1]，不仅能增强人体免疫力，抑制肿瘤细胞的产生，同时还具有抗氧化及防衰老的作用[2]。我国牛肝的产量很大，但是其加工方式原始而且附加值不高[3]，将牛肝加工成腊制品不仅有利于保存还提高了其经济价值。

腊制品是我国特有的传统发酵食品，因其色泽美观、风味独特、营养丰富、便于贮藏而具有广阔的消费市场和消费群体[4]。对于腌腊干制品来讲，风味是一项极其重要的品质指标，备受研究者的广泛关注。如尚永彪等[5]对川味腊肉各加工阶段的挥发性风味物质进行了比较，探究了川味腊肉风味形成的初步规律。粟桂蓉等[6]对传统土家腊肉加工过程中的挥发性风味成分进行了分析，发现不同种类的物质在加工过程中都发生了相应的变化。生肉几乎没有香味只是略带血腥味[7]，但腊肉风味独特，闻名于世，因为风味在其制作过程中经历了一个复杂的过程。郭兆斌等[8]对不同牛种肝脏的挥发性化合物含量进行了分析，发现醛类和烃类为其主体挥发性化合物。党欣等[9]研究表明，牛肝中与脂肪氧化有关的挥发性化合物，犊牦牛的含量明显高于成年牦牛。目前，针对新鲜牛肝挥发性风味物质的研究较多，但腊牛肝在加工过程中挥发性物质变化分析这方面的研究尚未报道。

本文采用固相微萃取(HS-SPME)与气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术，分析腊牛肝在加工过程中挥发性风味物质的组成及变化规律，并探讨各阶段的风味物质种类及特点，以期为腊牛肝风味品质评价、风味品质控制与改进等技术奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

随机选择发育正常、健康无病的 6头张掖地区肉牛(西门塔尔杂交牛，24 月龄)为试验对象。宰后取肝，洗去表面血迹和污物，除去脂肪等物质，于-18 ℃冰箱中冷冻保藏，待用；食盐，中盐榆林盐化有限公司；白砂糖、味精、花椒粉、五香粉等，哈尔滨康源食品原料有限公司；NaNO2，食品级，成都金山化学试剂有限公司。

试剂：NaCl(分析纯)，天津光复科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent公司(Agilent 6890 GC-5973MSD)；固相微萃取器(SPME)，美国SUPELCO公司(50/30 μm DVB/CAR/PDMS)；PB203-N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；HH-6型数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；LHS-150SC恒温恒湿培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；DW-25W518冰箱，青岛海尔电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 腊牛肝加工流程[10]

原料预处理→修整切形→腌制→腊制→成品

1.3.2 腊牛肝操作要点

将分割好的牛肝平均分为3组，对其进行腊牛肝的加工，具体操作方法见表1。

表1 腊牛肝操作要点Table 1 cured bovine liver operation points

1.3.3 取样

在加工过程中第0、1、2、3、4 d时每组分别取50 g 腊牛肝样品，其中0 d的样品为新鲜牛肝，1～2 d为腌制过程，3～4 d为腊制过程。将取好的样品切成末，置于100 mL萃取瓶中，-80 ℃下冻藏，待用。

1.3.4 挥发性风味物质的测定

肉样解冻后在萃取瓶中加入20%的NaCl，并将萃取瓶在80 ℃水浴锅中加热40 min；采用顶空固相微萃取方式采集挥发性化合物，在40 ℃恒温条件下，用手动SPME进样器吸附30 min，之后进行GC-MS检测。

色谱条件：TG-WAX色谱柱(60 m×0.25 mm×0.5 μm)；进样口温度220 ℃；升温程序：初温45 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃，保持 5 min；载气：高纯He；分流比30∶1；流速1.0 mL/min；不分流进样。

质谱条件：电子能量70 eV；四级杆温度180 ℃；离子源温度220 ℃；质量扫描范围50～450m/z。

1.3.5 数据分析

定性：化合物经计算机检索同时与NIST Library(107K compounds)和Wiley Library(320K compounds, version6.0)相匹配，仅报道匹配度和纯度大于800(最大值1 000)的鉴定结果。半定量：相对百分含量按峰面积归一化法计算。

对GC-MS定量分析结果用Excel 2016进行处理(计算平均值及标准差)和绘图。采用SPSS 19.0 统计分析软件对数据进行显著性分析(Duncan法)及主成分分析。

2 结果与分析

2.1 不同成熟时间腊牛肝中挥发性风味物质的变化

采用HS-SPME与GC-MS方法对腊牛肝加工过程中挥发性风味物质进行分析，图1为成品腊牛肝总离子流图。

图1 腊牛肝挥发性风味物质总离子流图Fig.1 Total ion flow diagram of volatile compounds in cured beef liver

腊牛肝在加工过程中0～4 d的挥发性风味物质检测结果见表2。在加工过程中，共分析筛选71种挥发性风味物质，分为9类，其中醇类14种，醛类10种，酸类7种，烃类13种，酮类4种，酯类16种，芳香类2种，杂环化合物3种，及其他物质2种。在加工第0，1，2，3，4天分别测定得到27，34，38，49，44种风味物质，且风味物质种类整体随加工时间呈上升趋势。

随着加工时间的增加，原来的风味物质出现了增加或减少的情况，同时也伴随着旧物质的减少和新物质出现的情况。在0天的样品中，主要成分为醇类和酸类物质。在第4天的样品中，主要成分为醇类、酯类和醛类物质。

表2 腊牛肝加工过程中挥发性风味物质相对含量Table 2 The relative content of volatile flavor components during processing of cured beef liver

续表2

序号保留时间/min化合物名称英文名称CAS号化学式相对含量/%0 d1 d2 d3 d4 d酮类(4)4520.77甲基庚烯酮methylheptenone110-93-0C8H14O0.54±0.01a——0.06±0.01b—4636.53胡椒酮p-menth-1-en-3-one89-81-6C10H16O——6.84±0.12a—3.64±0.07b4740.49香叶基丙酮geranylacetone689-67-8C13H22O—0.28±0.03a—0.21±0.02b—4843.55乙位紫罗兰酮irisone14901-07-6C13H20O————0.11±0.02总计0.54±0.01c0.28±0.03d6.84±0.12a0.27±0.03d3.75±0.09b酯类(16)495.24乙酸乙酯ethyl acetate141-78-6C4H8O2———0.23±0.02—5019.76庚酸乙酯ethylheptanoate106-30-9C9H18O2—4.32±0.18a—0.21±0.02b0.25±0.02b5120.17正己酸乙烯酯hexanoic acid, ethenylester3050-69-9C8H14O21.67±0.15————5221.07乳酸乙酯ethyl lactate97-64-3C5H10O3——2.45±0.07a0.66±0.04c1.57±0.01b5322.37辛酸乙酯ethylcaprylate106-32-1C10H20O2—1.00±0.12a0.73±0.07b0.68±0.06b0.88±0.05a5428.37壬酸乙酯ethylnonanoate123-29-5C11H22O2—0.94±0.03a—0.34±0.03b0.35±0.01b5532.31癸酸乙酯ethylcaprate110-38-3C12H24O2—0.79±0.07b1.35±0.04a0.58±0.06b0.65±0.03b5634.49丁二酸二乙酯diethylsuccinate123-25-1C8H14O4——0.62±0.03a0.23±0.02b0.27±0.02b5739.68月桂酸乙酯ethyllaurate106-33-2C14H28O2—0.87±0.02c1.16±0.04c1.66±0.03b2.68±0.06a5844.87十四酸乙酯ethylmyristate124-06-1C16H32O2—1.32±0.03b0.66±0.03c3.31±0.07a3.36±0.08a5948.56十五酸乙酯pentadecanoic acid,ethyl ester41114-00-5C17H34O2—0.83±0.03 d2.62±0.07a1.92±0.07b1.46±0.05c6050.33硬脂酸乙酯ethyloctadecanoate111-61-5C20H40O2—4.60±0.08a0.45±0.03c1.22±0.03b0.99±0.06b6151.25棕榈酸乙酯ethylpalmitate628-97-7C18H36O2—6.45±0.04b6.52±0.05a5.83±0.05c6.67±0.04a6251.58油酸乙酯ethyloleate111-62-6C20H38O2———0.61±0.020.77±0.056353.659-十六碳烯酸乙酯9-hexadecenoicacid,ethyl ester54546-22-4C18H34O2—0.90±0.05a0.34±0.03b0.59±0.02a0.64±0.03a6453.75亚油酸乙酯ethyl linoleate7619-08-1C20H36O21.04±0.04————总计2.71±0.19e22.02a±0.5116.90±0.19d17.84±0.36c20.54±0.36b芳香类(2)6546.22苯酚phenol108-95-2C6H6O0.85±0.01————6648.654-甲基苯酚p-cresol106-44-5C7H8O2.5±0.08————总计3.35±0.070.000.000.000.00杂环化合物类(3)6716.72邻异丙基甲苯o-cymene527-84-4C10H14—0.14±0.03b—0.34±0.03b0.58±0.04a6817.15间异丙基甲苯m-cymene535-77-3C10H14———0.55±0.02—6917.174-异丙基甲苯4-isopropyltoluene99-87-6C10H14——0.74±0.03——总计0.000.14±0.03d0.74±0.03b0.89±0.01a0.58±0.04c其他(2)7026.434-乙基-5-甲基噻唑4-ethyl-5-methylthiazole52414-91-2C6H9NS———0.24±0.02—7140.074-烯丙基苯甲醚4-allylanisole140-67-0C10H12O————0.54±0.03总计0.000.000.000.24±0.02b0.54±0.03a

注：“—”表示未检出，同一行数据肩标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

第4天与第0天相比，醇类与酸类物质含量分别减少了20.66%、25.64%，说明腊牛肝的腥味和不愉快的味道减少；酯类和醛类物质的含量分别增加了17.83%、9.07%， 酯类和醛类都是组成腊肉风味特征的重要物质。酯类主要来源于腊肉中酸类和醇类化合物之间发生的酯化反应，具有香甜的果香味[11]。醛类赋予腊牛肝独特的清香、油香、脂香风味，在腊牛肝中含量较高，这与周才琼等[12]的研究相符。

2.2 不同种类风味物质变化分析

在腊牛肝加工过程中检测到的不同种类挥发性风味物质的相对含量如图1所示。

图2 腊牛肝加工过程中各类挥发性风味物质相对含量变化Fig.2 Relative content of various volatile flavor substances in the processing of cured beef liver

2.2.1 醛类物质变化分析

研究表明，醛类物质主要由脂肪的氧化和降解产生，其中显著影响腊牛肝风味的高分子质量饱和醛和不饱和醛是由多不饱和脂肪酸的过氧化物降解生成的[13]。由表2和图1可知，从1～4 d的样品中共检测出15种醛类，除腌制第1天时相对含量减少外，其余天数都呈显著上升趋势(P<0.05)，这可能是因为在腌制第一天时醛类氧化产生了其他物质。醛类化合物的阈值很低(0.2 μg/kg)，3～4个碳原子的醛具有强烈的刺激性气味，5～9个碳原子的醛具有清香、油香、脂香风味，分子质量较高的醛具有橘子皮似的风味[14]。在检出的醛类中，己醛具有果香、柑橘香、生的油脂味等香味[15]；壬醛具有甜橙味、柠檬味和油脂味；2-辛烯醛具有脂肪香气味；反式-2,4-癸二烯醛具有清香，脂肪香和油炸香味，由脂肪氧化产生[15]；苯甲醛具有樱桃、苦杏仁及坚果香味，是苯丙氨酸的降解产物[16]。

2.2.2 醇类物质变化分析

腌制1 d的样品与未腌制的空白样品相比，醇类的相对含量增加了12.85%，这可能是由于脂肪氧化产生醇类[17]，导致醇类种数和相对含量增加。在腊牛肝加工的1～4 d，醇类的种数和相对含量逐渐下降，SHAHIDI等[18]研究认为，这可能是由于醇类在加工过程中发生了酯化、氧化反应，也有可能是因为腌制能抑制脂肪氧化[17]。醇类因其独特的香味，赋予了腊牛肝浓郁的醇香。直链饱和醇的香味阈值(500～20 000 μg/kg)相对其他羰基化合物较高，随着碳链的增长可产生出清香、木香、脂肪香的特征[19]。在检出的醇类中，乙醇、正己醇具有芳香气味，1-辛烯-3-醇具有蘑菇香、泥土香味，α-松油醇具有丁香味，苯乙醇具有玫瑰香味[8]。

2.2.3 酸类和酮类物质变化分析

在腊牛肝加工过程中检出的酸类和酮类物质的相对含量较少。酸类物质由脂肪氧化、水解产生[20]，对腊牛肝的风味有着重要影响。近年来，酸价问题一直限制着传统腊肉制品市场拓展，所以解决腊肉制品酸价问题迫在眉睫。通过分析结果发现，1～4 d共检测出酸类物质5种，乙酸含量最高，对腊牛肝风味影响不大。酮类物质一般由美拉德反应生成，也可由醇类氧化、酯类分解得到[15]。腊牛肝中的蛋白类化合物能与酮类物质发生反应，形成特征性的色泽，所以，酮类物质对产品的色泽有一定影响。由于腊牛肝烟熏后颜色发黑，所以腊牛肝一般不烟熏，这可能是造成酮类物质较少的原因。

2.2.4 烃类物质变化分析

检出的烃类物质有烷烃和烯烃，研究发现脂肪氧化可产生直链烷烯烃，直链脂肪酸降解氧化可产生直链烷烃[21]。在检出的烃类物质中，月桂烯具有香脂香味，柠檬烯具有柠檬香气，反式-β-罗勒烯具有青香、木香和蔬菜风味[8]，月桂烯、萜品油烯、反式-β-罗勒烯是组成腊味的一部分挥发性风味物质。在腊牛肝加工过程中检出的烃类物质相对含量较大，是因为腊制温度较高，提高了脂肪酶的活性，使脂肪水解出更多的烃类。烷烃类化合物的阈值较高，但它们有助于提高腊牛肝整体香味的效果。

2.2.5 酯类和其他物质变化分析

酯类物质是腊牛肝非常重要的物质，影响着腊牛肝制品整体风味的形成。一般而言，除内酯和硫酯以外的酯阈值较高，酯类会给予腊牛肝香甜的果香[18]。在腊牛肝加工过程中，由于受到各种因素的共同影响，脂肪不断水解、氧化，产生游离脂肪酸，脂肪酸与醇类物质反应产生酯类物质[22]。1～4 d共检出的酯类物质有17种，其中最主要的酯类物质是棕榈酸乙酯。本实验中检出的其他物质有杂环化合物、噻唑，他们是香味化合物的重要组成部分，主要来源于美拉德反应[23]。美拉德反应是腊牛肝中产生风味物质的重要途径。

2.3 因子分析

各主成分因子的特征值及其方差贡献率计算结果见表3。由表3可以看出，前3个成分的累计方差贡献率已达89.057%，能够反映腊牛肝原始数据的大部分信息，因此本研究选择前3个成分为主成分因子。

表3 主成份因子的特征值及其方差贡献率Table 3 Eigenvalues, contribution and cumulative contribution of principal components

旋转后主成分因子的成份矩阵见表4。

由表4可知，与PC1高度相关的物质有反式-2,4-癸二烯醛、甲基庚烯酮、棕榈酸乙酯、1-辛烯-3-醇、2-甲基戊酸、己酸、正辛醛等，主要来自于脂肪氧化。脂肪氧化对腊牛肝风味的形成具有决定性的作用。

表4 旋转后主成分因子的成份矩阵Table 4 otating principal components loading matrix

TOLDRA等[24]研究发现，干腌火腿中的挥发性成分有567种，大部分由脂质的自动氧化形成。脂质氧化主要包括两个方面：一是含双键的脂肪酸易氧化生成过氧化物，进一步分解为香阈值很低的酮、醛、酸等挥发性羰基化合物；二是含羟基的脂肪酸水解后生成羟基酸，经过加热脱水、环化生成具有肉香味的内酯化合物[17]。

与PC2高度相关的挥发性风味物质有壬醛、丁二酸二乙酯、胡椒酮、乳酸乙酯、苯乙醇、癸酸、环己醇等，主要来源于前体物质的降解。腌腊肉制品风味的前体物质主要分为两大类：水溶性成分和脂质。水溶性风味前体物质主要有：糖类、游离氨基酸、肽、核苷酸和其他的含氮组分等。脂溶性前体物质主要有：甘油三酯、游离脂肪酸、磷脂和羰基化合物等[9]。

与PC3高度相关的有2-苯基巴豆醛、正十五碳醛、3-蒈烯、间异丙基甲苯、4-乙基-5-甲基噻唑、乙酸乙酯、b-崖柏烯等物质，主要来自于美拉德反应。美拉德反应利用氨基酸和还原糖之间的反应，可以产生多种肉类挥发性风味化合物，如吡嗪类、噻吩类、噻唑等[25]。不同的α-氨基酸和还原糖的反应，能按Strecker降解生成一些挥发性的醛、酮等物质，给腊牛肝带来悦人的色泽和风味[25]。

2.4 腊牛肝与传统腊肉特征性风味物质的对比

传统腊肉的特征挥发性风味物质主要为酚类、醛类和酮类[13]，而腊牛肝的特征挥发性风味物质为醇类、醛类、和酯类，这是因为加工原料和加工工艺的不同。醇类和酯类是牛肝本身所具有的特征风味物质[2]，赋予牛肝独特的清香味；酮类和酚类物质主要在烟熏过程产生，腊牛肝烟熏后色泽发黑，一般不进行烟熏工艺，这是腊牛肝酮类和酚类物质较少的原因。二者共同的特征性风味物质是醛类，醛类一般由脂肪氧化产生，具有清香、油香、脂香，是组成腊味的重要物质。

3 结论

(1)在腊牛肝加工过程中共检测出71种挥发性风味物质，主要为醇类、醛类、烃类和酯类。第4天与第0天的样品相比，呈现腥味和不愉快气味的酸类物质含量显著减少，呈现清香、油香和脂香味的酯类和醛类物质含量显著增加，其他物质含量变化不明显，说明将牛肝加工成腊牛肝可以去腥增香。

(2)主成分分析将腊牛肝加工过程中的风味物质共分为三类，分别是脂肪氧化产物、前体物质降解产物、美拉德反应产物。

(3)腊牛肝的特征性风味物质是醇类、醛类和酯类，其中己醛、壬醛、反式-2,4-癸二烯醛、1-辛烯-3-醇、乙醇、正己醇、棕榈酸乙酯等是组成腊牛肝风味的重要物质。